Método para obtener patrón de respiración en ratones senescentes a través de la pletimografía barométrica sin restricciones
Summary
La pletimografía barométrica sin restricciones se utiliza para cuantificar el patrón de respiración en ratones despiertos. Mostramos que los segmentos de 15 s bajo un protocolo estandarizado muestran valores similares a una duración prolongada de respiración silenciosa. Esta metodología también permite la cuantificación de la apnea y las respiraciones aumentadas durante la primera hora en la cámara.
Abstract
La pletimografía barométrica sin restricciones (UBP) es un método para cuantificar el patrón de respiración en ratones, donde se notifica rutinariamente la frecuencia respiratoria, el volumen de marea y la ventilación diminosa. Además, se puede recopilar información sobre la salida neuronal de la respiración, incluyendo la existencia de apneas centrales y respiraciones aumentadas. Una consideración importante para la UBP es la obtención de un segmento respiratorio con un impacto mínimo de comportamientos ansiosos o activos, para dilucidar la respuesta a los problemas respiratorios. Aquí, presentamos un protocolo que permite obtener líneas de base cortas y silenciosas en ratones envejecidos, comparables a esperar más largos de respiración tranquila. El uso de segmentos de tiempo más cortos es valioso, ya que algunas cepas de ratones pueden ser cada vez más excitables o ansiosos, y períodos más largos de respiración silenciosa pueden no lograrse dentro de un plazo razonable. Colocamos ratones de 22 meses de edad en una cámara UBP y comparamos cuatro segmentos de respiración silenciosa de 15 s entre los minutos 60-120 y un período de respiración silenciosa más largo de 10 minutos que tardó de 2 a 3 horas en adquirirse. También obtuvimos recuentos de apneas centrales y respiraciones aumentadas antes de los segmentos de respiración tranquila, después de un período de familiarización de 30 minutos. Mostramos que 10 minutos de respiración silenciosa es comparable a usar una duración mucho más corta de 15 s. Además, el tiempo que conduce a estos 15 segmentos de respiración silenciosa se puede utilizar para recopilar datos sobre apneas de origen central. Este protocolo permite a los investigadores recopilar datos de patrón de respiración en una cantidad determinada de tiempo y hace que las medidas de referencia silenciosas sean factibles para ratones que pueden exhibir mayores cantidades de comportamiento excitable. La propia metodología UBP proporciona una forma útil y no invasiva de recopilar datos de patrones de respiración y permite que los ratones se prueben en varios puntos de tiempo.
Introduction
UBP es una técnica común para la evaluación de patrones respiratorios1,2,3,4. En este método, los ratones se colocan en una cámara cerrada donde las diferencias de presión entre la cámara principal (donde el animal está alojado) y una cámara de referencia se filtran a través de un neumotachogramógrafo para obtener valores. La configuración de UBP resultante no es invasiva y sin restricciones y permite evaluar las medidas respiratorias sin necesidad de anestesia o cirugía. Además, esta técnica es adecuada para estudios que requieren múltiples mediciones en el mismo ratón a lo largo del tiempo. Variables como la frecuencia respiratoria, el volumen de marea y la ventilación diminal se pueden cuantificar con este método, durante un solo ensayo o durante varios ensayos. La UBP de todo el cuerpo también proporciona medidas de flujos máximos y duración del ciclo respiratorio. Juntos, estos parámetros cuantifican el patrón de respiración. Los rastros respiratorios registrados también permiten revisar los datos y contar el número de apneas centrales mostradas dentro de un período de tiempo determinado. Este recuento se puede utilizar junto con un análisis del volumen de marea y los tiempos inspiratorios para medir otras alteraciones en el patrón de respiración.
Mientras que existen varias técnicas de pletimismografía no invasiva para la evaluación directa de los parámetros fisiológicos pulmonares, UBP de todo el cuerpo permite una manera de detectar la función respiratoria con un mínimo estrés indebido para el ratón. La pletimografía head-out, que utiliza medidas de flujo midexpiratorio de marea y también no es invasiva, se basa en la restricción, como muchos otros tipos de pletimografía (por ejemplo, pletismografía de doble cámara). Si bien estos métodos se han utilizado en modelos de roedores para medir la capacidad de respuesta de las vías respiratorias5, el uso de cuellos o pequeños tubos de retención puede llevar ratones (frente a otras especies) más tiempo para aclimatarse y devolver su respiración a los niveles de reposo.
La obtención de un segmento óptimo de respiración del aire es una consideración importante para las comparaciones de línea de base. El mayor uso de los sistemas de pletimografía disponibles comercialmente hace posible la recopilación de datos de patrones de respiración en muchos laboratorios. Es importante destacar que el patrón de respiración es variable durante todo el período de recolección, especialmente para ratones. Dicho esto, es necesario estandarizar el análisis de línea de base como un medio para garantizar que el nivel de formación de los experimentadores no confunde los resultados. Hay numerosas maneras de recoger un segmento de respiración del aire, sirviendo como un área de variación entre los diseños experimentales. Un ejemplo incluye promediar los últimos 10-30 minutos de datos después de un conjunto de tiempo previamente definido dentro de la cámara1, mientras que otro método implica esperar hasta que el ratón esté visiblemente tranquilo durante 5-10 min6. Este último puede tomar de 2 a 3 h para lograr y, en algunos casos, un ensayo puede necesitar ser abandonado si el ratón no está tranquilo durante el tiempo suficiente. Esta preocupación es una consideración especialmente importante para las cepas de ratones donde los comportamientos observados son más ansiosos y excitables7. Estos ratones pueden tardar más en adaptarse al entorno de la cámara y sólo permanecen tranquilos durante breves ráfagas de tiempo. Limitar el tiempo dedicado a la colección de líneas base estandariza el tiempo de cámara para cada ratón.
Es crucial que los experimentadores obtengan una línea base adecuada que abarque los valores de comportamiento en reposo en el ratón, pero también se produzca de manera oportuna. Por lo tanto, el objetivo de este informe es proporcionar una descripción de los métodos utilizados para obtener valores de referencia silenciosos cortos para los parámetros de respiración en ratones. Además, informamos que las apneas y las respiraciones aumentadas se pueden cuantificar durante la primera hora en la cámara.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo proporciona información sobre una línea de base de respiración silenciosa en ratones, así como la recopilación de datos sobre apneas centrales y respiraciones aumentadas. Los resultados representativos muestran que una línea de base silenciosa de 10 minutos tiene un patrón de respiración similar en comparación con un promedio de cuatro peleas de 15 s para una cohorte de ratones viejos. Es importante destacar que los 15 s no son estadísticamente diferentes, ni estos grupos tienen diferencias en la v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Angela Le, Sarah Ruby y Marisa Mickey por su trabajo manteniendo las colonias de animales. Este trabajo fue financiado por 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. para apoyar al CNR), y la Beca McDevitt de Investigación de Grado en Ciencias Naturales (BEE).
Materials
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen – food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
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