طريقة للحصول على نمط التنفس في الفئران Senescent من خلال التصوير البهو غير المقيد البارومترية
Summary
يستخدم التصوير البهوي البثري غير المقيد لقياس نمط التنفس في الفئران المستيقظة. نظهر أن 15 شريحة s في إطار بروتوكول موحد تعرض قيمًا مماثلة لفترة طويلة من التنفس الهادئ. تسمح هذه المنهجية أيضًا بالقياس الكمي لانقطاع النفس والأنفاس المعززة خلال الساعة الأولى في الغرفة.
Abstract
التصوير البهوي البُقيّمي غير المقيّد (UBP) هو طريقة لقياس نمط التنفس لدى الفئران، حيث يتم الإبلاغ بشكل روتيني عن تواتر التنفس وحجم المد والجزر والتهوية الدقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن جمع المعلومات المتعلقة بالناتج العصبي للتنفس، بما في ذلك وجود انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة. أحد الاعتبارات الهامة لUBP هو الحصول على شريحة التنفس مع الحد الأدنى من تأثير السلوكيات القلقة أو النشطة ، لتوضيح الاستجابة لتحديات التنفس. هنا، نقدم بروتوكول يسمح بالحصول على خطوط أساس قصيرة وهادئة في الفئران القديمة، مقارنة بالانتظار لنوبات أطول من التنفس الهادئ. استخدام شرائح زمنية أقصر أمر قيم ، حيث أن بعض سلالات الفئران قد تكون متحمسة أو قلقة بشكل متزايد ، وقد لا يتم تحقيق فترات أطول من التنفس الهادئ في غضون إطار زمني معقول. وضعنا فئرانعمرها 22 شهرًا في غرفة UBP وقارننا أربعة أجزاء تنفس هادئة من 15 ثانية بين دقائق 60-120 بفترة تنفس هادئة أطول مدتها 10 دقائق استغرقت 2-3 ساعات للحصول عليها. كما حصلنا على عدد من انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة قبل أجزاء التنفس الهادئة ، بعد فترة تعريف 30 دقيقة. نظهر أن 10 دقيقة من التنفس الهادئ مماثلة لاستخدام أقصر بكثير 15 سنة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الوقت المؤدي إلى هذه الأجزاء التنفس 15 s هادئة لجمع البيانات المتعلقة انقطاع النفس من المنشأ المركزي. يسمح هذا البروتوكول للمحققين بجمع بيانات نمط التنفس في فترة زمنية محددة ويجعل تدابير خط الأساس الهادئة ممكنة للفئران التي قد تظهر كميات متزايدة من السلوك المنفعل. توفر منهجية UBP نفسها طريقة مفيدة وغير باضعة لجمع بيانات نمط التنفس وتسمح باختبار الفئران عبر عدة نقاط زمنية.
Introduction
UBP هو تقنية شائعة لتقييم أنماط التنفس1،2،3،4. في هذه الطريقة ، يتم وضع الفئران في غرفة مغلقة حيث اختلافات الضغط بين الغرفة الرئيسية (حيث يتم إيواء الحيوان) وغرفة مرجعية يتم تصفيتها من خلال pneumotachograph للحصول على القيم. إعداد UBP الناتج غير جراحي وغير مقيد ويسمح بتقييم التدابير التنفسية دون الحاجة إلى التخدير أو الجراحة. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية مناسبة للدراسات التي تتطلب قياسات متعددة في نفس الماوس مع مرور الوقت. يمكن قياس المتغيرات مثل تردد التنفس وحجم المد والجزر والتهوية الدقيقة باستخدام هذه الطريقة، أثناء تجربة واحدة أو عبر عدة تجارب. كما يوفر برنامج برمودا المتحد في الجسم كله مقاييس لذروة التدفقات ومدة الدورة التنفسية. معا، هذه المعلمات تحديد نمط التنفس. كما أن آثار التنفس المسجلة تجعل من الممكن استعراض البيانات وحساب عدد انقطاع النفس المركزي المعروض في غضون فترة زمنية معينة. يمكن استخدام هذا العد جنبا إلى جنب مع تحليل حجم المد والجزر وأوقات ملهمة لقياس التغيرات الأخرى في نمط التنفس.
في حين أن العديد من تقنيات التصوير بالجنب غير الغازية موجودة للتقييم المباشر للمعلمات الفسيولوجية الرئوية ، فإن UBP كامل الجسم يسمح بوسيلة لفحص وظيفة الجهاز التنفسي مع الحد الأدنى من الإجهاد غير المبرر للفأر. ويعتمد التصوير بالجنب، الذي يستخدم مقاييس تدفق المد والجزر المتوسطة المنهية وغير الباضعة أيضاً، على ضبط النفس، مثل العديد من الأنواع الأخرى من التصوير بالبليسيوم (على سبيل المثال، التصوير بالحجرة المزدوجة). في حين تم استخدام هذه الأساليب في نماذج القوارض لقياس استجابة مجرى الهواء5، فإن استخدام أطواق الرقبة أو أنابيب ضبط النفس الصغيرة قد يستغرق الفئران (مقابل الأنواع الأخرى) لفترة أطول للتأقلم مع التنفس وإعادته إلى مستويات الراحة.
يعد الحصول على الجزء الأمثل من تنفس الهواء اعتبارًا مهمًا للمقارنات الأساسية. زيادة استخدام نظم التصوير بالبليسيوم المتاحة تجاريا يجعل جمع بيانات نمط التنفس ممكن في العديد من المختبرات. الأهم من ذلك ، نمط التنفس متغير طوال فترة الجمع ، وخاصة بالنسبة للفئران. ومع ذلك، من الضروري توحيد التحليل الأساسي كوسيلة لضمان ألا يؤدي مستوى تدريب المجربين إلى إرباك النتائج. هناك العديد من الطرق لجمع جزء تنفس الهواء، بمثابة منطقة واحدة من الاختلاف بين التصاميم التجريبية. ومن الأمثلة على ذلك متوسط البيانات النهائية التي تتراوح بين 10 و30 دقيقة بعد مجموعة زمنية محددة مسبقًا داخل الغرفة1، في حين تتضمن طريقة أخرى الانتظار حتى يكون الماوس هادئًا بشكل واضح لمدة 5-10 دقيقة6. يمكن أن يستغرق هذا الأخير 2-3 ساعة لتحقيق وفي بعض الحالات ، قد تحتاج إلى التخلي عن المحاكمة إذا لم يكن الماوس هادئًا لفترة كافية. هذا القلق هو اعتبار مهم بشكل خاص لسلالات الفئران حيث السلوكيات الملاحظة هي أكثر قلقا ومثيرة7. قد تستغرق هذه الفئران وقتًا أطول للتكيف مع بيئة الغرفة وتظل هادئة فقط لرشقات نارية قصيرة من الوقت. يحد من الوقت المخصص لجمع خط الأساس يوحد وقت الغرفة لكل فأرة.
من الأهمية بمكان أن يحصل المجرّبون على خط أساس مناسب يشمل قيم سلوك الراحة في الماوس ولكن يحدث أيضًا في الوقت المناسب. وبالتالي ، فإن الهدف من هذا التقرير هو تقديم وصف للطرق المستخدمة للحصول على قيم خط الأساس الهادئة القصيرة لمعلمات التنفس في الفئران. وعلاوة على ذلك، فإننا نبلغ بأن انقطاع النفس والأنفاس المعززة يمكن قياسها كميا خلال الساعة الأولى في القاعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول معلومات حول خط أساس التنفس الهادئ في الفئران ، بالإضافة إلى جمع البيانات حول انقطاع النفس المركزي والأنفاس المعززة. تظهر النتائج التمثيلية أن خط الأساس الهادئ لمدة 10 دقيقة يحتوي على نمط مماثل من التنفس بالمقارنة مع متوسط أربع نوبات 15 s لفوج من الفئران القديمة. الأهم من ذلك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفان أن يشكرا أنجيلا لو وسارة روبي وماريسا ميكي على عملهم في الحفاظ على مستعمرات الحيوانات. تم تمويل هذا العمل من قبل 1R15 HD076379 (L.R.D.) ، 3R15 HD076379 (L.R.D. لدعم CNR) ، وزمالة أبحاث ماكديفيت الجامعية في العلوم الطبيعية (BEE).
Materials
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen – food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
