Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II
Summary
O perfilamento Proteomic de proteínas tyrosine-nitrated foi uma técnica desafiante devido à baixa abundância da modificação da 3-nitrotyrosine. Aqui nós descrevemos uma aproximação nova para o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptide usando a angiotensina II como o modelo. Este método pode ser estendido para outros sistemas in vitro ou in vivo .
Abstract
A nitração proteica é uma das mais importantes modificações pós-translacionais (PTM) sobre os resíduos de tirosina e pode ser induzida por ações químicas de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) em células eucarióticas. A identificação precisa dos sítios de nitorização nas proteínas é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos relacionados à nitração proteica, como inflamação, envelhecimento e câncer. Desde que as proteínas sulfonados são da baixa abundância nas pilhas mesmo circunstâncias induzidas, nenhuns métodos universais e eficientes foram desenvolvidos para o perfilamento e a identificação de locais da nitração da proteína. Aqui nós descrevemos um protocolo para o enriquecimento do nitropeptide usando uma reação da redução química e a rotulagem da biotina, seguidas pela espectrometria maciça de alta resolução. Em nosso método, os derivados de nitropeptídeos podem ser identificados com alta precisão. Nosso método exibe duas vantagens em comparação com os métodos relatados anteriormente. Primeiro, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear a amina primária em nitropeptídeos, que podem ser usados para gerar resultados quantitativos. Em segundo, uma ligação do dissulfeto que contem o reagente de NHS-biotina é usada para o enriquecimento, que pode mais ser reduzido e alquilados para realçar o sinal da deteção em um espectrómetro maciço. Este protocolo foi aplicado com sucesso ao peptide modelo angiotensina II no papel atual.
Introduction
A nitração de resíduos de tirosina em proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muitos processos biológicos. Devido às diferentes propriedades químicas entre tirosina e 3-nitrotirosina, uma proteína nitrada pode ter perturbado a atividade de sinalização1,2. Conseqüentemente, é importante desenvolver os métodos que podem enriquecer e identificar locais da nitração em proteínas eficientemente. Como 3-nitrotirosina é uma modificação de baixa abundância em proteínas em comparação com outras formas de PTM, como fosforilação e acetilação, é desafiador para identificar locais de nitração endógena diretamente de linhas celulares ou amostras de tecido. No entanto, a metodologia de uso de espectrometria de massas (MS) para caracterizar o padrão de fragmentação do nitrotpeptídeo foi desenvolvida (por exemplo, Zhan & Desiderio3), que estabelece a base para novos métodos de nitroproteômica.
Atualmente, uma etapa de enriquecimento seguida por MS é a estratégia mais poderosa para o perfilamento de nitropeptídeos4,5. Os métodos de enriquecimento podem ser classificados em duas classes. Uma classe é baseada em anticorpos que podem reconhecer a 3-nitrotirosina especificamente, enquanto que a outra classe é baseada na derivação química que reduz um grupo nitro para um grupo de amina4,5. Para o método baseado em anticorpos, a coluna de afinidade com nitrotirosina é utilizada para o enriquecimento, a partir do qual o material eluído é ainda mais resolvido e analisado por MS6,7de alta resolução. Para o método baseado na derivação química, os grupos de amina no N-Terminus do peptídeo ou lisina devem ser bloqueados no primeiro passo, quer por acetilação, Tags isobáricas para a quantificação relativa e absoluta (iTRAQ), ou tag de massa em tandem (TMT) reagentes. Em seguida, um redutor é usado para reduzir a nitrotirosina à aminotirosina seguida modificando o grupo recentemente formado da amina, que inclui a ligadura da biotina, a conversão do peptide do sulfidrilo, ou outros tipos de sistemas de etiquetagem8,9, 10,11. A maioria dos protocolos estabelecidos até agora baseiam-se em proteínas em excesso nitradas in vitro , em vez de proteínas endogenamente nitradas.
No presente estudo, um procedimento modificado da derivação química da nitrotirosina é desenvolvido para o enriquecimento e identificação do nitropeptídeo, o que mostra maior sensibilidade durante a detecção de SM e é adequado para fins de quantificação. Nosso estudo recente que emprega este método nos sistemas biológicos identificou que o nitração da proteína tirosina-quinase lymphocyte-específica (lck) em Tyr394 por RNS produziu das pilhas Myeloid-derivadas do supressor (mdscs) joga um papel importante no imunossupressão do microambiente do tumor12. Conseqüentemente, nosso método da identificação do nitropeptide pode ser aplicado às amostras biológicas complexas também. Aqui, nós descrevemos nosso protocolo usando o peptide modelo angiotensina II, de que o teste padrão da fragmentação é sabido e amplamente utilizado em estudos nitroproteomic8,9,10,11, como um exemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descreve o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptídeo. Utilizando-se a angiotensina II como peptídeo modelo, ilustramos o procedimento mostrado na Figura 1. Após a obtenção da nitro-angiotensina II, a amina primária no peptídeo deve ser bloqueada para evitar a conjugação de amina, que é uma das etapas mais críticas dentro do protocolo. No protocolo atual, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear as aminas primárias por dois motivos: primeiro, possibili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela American Cancer Society institucional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack é investigador principal; X.L. é um investigador subdestinatário). Esta publicação foi possível com apoio parcial de Grant Numbers KL2 TR002530 e UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) dos institutos nacionais de saúde, centro nacional para o avanço das Ciências translacionais, prêmio de ciências clínicas e translacionais. X. L. é um receptor de Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. é apoiado pela Walther Cancer Foundation avançando subsídios de câncer básico. X. W. é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China programa geral (Grant no. 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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