アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定
Summary
チロシン硝化タンパク質のプロテオミックプロファイリングは、3-ニトロチロシン修飾の低い存在性のために挑戦的な技術であった。ここでは、アンジオテンシンIIをモデルにしたニトロペプチド濃縮とプロファイリングに対する新しいアプローチについて述べた。この方法は、他のインビトロまたはインビボシステムに拡張することができます。
Abstract
タンパク質硝化は、チロシン残基に対する最も重要な翻訳後修飾(PTM)の1つであり、真核細胞における活性酸素種(ROS)および反応性窒素種(RNS)の化学作用によって誘導されうる。タンパク質上の硝化部位の正確な同定は、炎症、老化、癌などのタンパク質硝化に関連する生理学的および病理学的プロセスを理解するために重要です。硝化タンパク質は、誘導条件下でも細胞内の存在量が少ないため、タンパク質硝化部位のプロファイリングと同定のための普遍的かつ効率的な方法は開発されていません。ここでは、化学還元反応とビオチン標識を用いてニトロペプチド濃縮のためのプロトコルを説明し、続いて高分解能質量分析を行う。我々の方法では、ニトロペプチド誘導体を高精度で同定することができる。我々の方法は、以前に報告された方法と比較して2つの利点を示す。まず、ジメチル標識は、ニトロペプチド上の一次アミンをブロックするために使用され、定量的な結果を生成するために使用することができます。第二に、NHS-ビオチン試薬を含むジスルフィド結合が濃縮に使用され、質量分析計上の検出信号を増強するためにさらに低減およびアルキル化することができる。このプロトコルは、現在の論文においてモデルペプチドアンジオテンシンIIに正常に適用されている。
Introduction
3-ニトロチロシンを形成するタンパク質中のチロシン残化の硝化は、多くの生物学的プロセスを調節する。チロシンと3-ニトロチロシンの間の異なる化学的特性のために、硝化されたタンパク質はシグナル伝達活性1、2を乱暴にしてもよい。そのため、タンパク質上の硝化部位を効率的に濃縮・同定できる方法を開発することが重要です。3-ニトロチロシンは、リン酸化やアセチル化などの他の形態のPTMと比較してタンパク質に対する豊富な修飾が低いため、細胞株や組織サンプルから直接内因性の硝化部位を同定することは困難です。それにもかかわらず、ニトロペプチドの断片化パターンを特徴付けるために質量分析(MS)を用いた方法論(例えば、Zhan & Desiderio 3)が開発され、これはニトロプロテオミクスの新しい方法の基礎を築く。
現在、MSに続く濃縮ステップは、ニトロペプチドプロファイリング4、5のための最も強力な戦略です。エンリッチメント メソッドは、2 つのクラスに分類できます。1つのクラスは、3-ニトロチロシンを特異的に認識できる抗体に基づいており、他のクラスは、アミン基4、5にニトロ基を減少させる化学誘導法に基づいている。抗体ベースの方法では、ニトロチロシン親和性カラムが濃縮に使用され、そこから、解離された材料がさらに高分解能MS6、7によって分解および分析される。化学誘導ベースの方法では、ペプチドまたはリジンのN終位におけるアミン基は、アセチル化、相対および絶対定量のための同位体タグ(iTRAQ)、またはタンデム質量タグ(TMT)試薬のいずれかによって最初のステップでブロックされるべきである。次に、ミトロチロシンをアミノチロシンに還元し、続いて新たに形成されたアミン群を改変するためにリデューサを使用し、ビオチンライゲーション、スルフィドリルペプチド変換、または他のタイプのタグ付けシステム8、9、および 10、11.これまでに確立されたプロトコルのほとんどは、内因性硝化タンパク質の代わりに、インビトロの過剰硝化タンパク質に基づいています。
本研究では、ニトロチロシンの化学誘導法の改変手順を、MS検出時の感度向上を示し、定量化目的に適したニトロペプチド濃縮および同定のために開発される。この手法を生物系に用いた最近の研究では、骨髄系抑制細胞(MDSC)から産生されるRNSによるTyr394におけるリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)の硝化が重要な役割を果たしていることを明記した。腫瘍微小環境の免疫抑制12.したがって、我々のニトロペプチド同定の方法は、複雑な生物学的試料にも適用することができる。ここで、フラグメンテーションパターンが知られており、ニトロプロテオミクス研究8、9、10、11で広く使用されているモデルペプチドアンジオテンシンIIを例として我々のプロトコルを説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでのプロトコルは、ニトロペプチド濃縮およびプロファイリングについて説明する。モデルペプチドとしてアンジオテンシンIIを用いて、図1に示す手順を示した。ニトロアンジオテンシンIIを得た後、ペプチド上の一次アミンは、プロトコル内で最も重要なステップの1つであるさらなるアミン結合を避けるためにブロックされるべきである。現在のプロトコルでは?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国癌学会機関研究助成金IRG-14-195-01(M.シャロンスタックは主任研究者です。X.L.は、サブ受信者調査員です。この出版物は、国立衛生研究所、国立翻訳科学、臨床および翻訳科学賞のグラント番号KL2 TR002530とUL1 TR002529(A.シェカール、PI)からの部分的な支援によって可能になりました。X. L. はインディアナ CTSI KL2 若手研究者賞を受賞しています。S.F.は、基本がん助成金を推進するワルサー癌財団によって支援されています。X.W.は、中国国立自然科学財団(助成第817773047号)の支援を受けています。
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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