Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II
Summary
La profilazione proteomica delle proteine tirosine-nitrirate è stata una tecnica impegnativa a causa della bassa abbondanza della modifica 3-nitrotyrosine. Qui descriviamo un nuovo approccio per l’arricchimento e la profilazione dei nitropeptidi usando Angiotensin II come modello. Questo metodo può essere esteso per altri sistemi in vitro o in vivo.
Abstract
La nizione proteica è una delle più importanti modifiche post-traduzionali (PTM) sui residui di tirosina e può essere indotta da azioni chimiche di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e specie reattive di azoto (RNS) nelle cellule eucariotiche. L’identificazione precisa dei siti di nitrazione sulle proteine è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici correlati alla nitrazione delle proteine, come infiammazione, invecchiamento e cancro. Poiché le proteine netorate sono di scarsa abbondanza nelle cellule anche in condizioni indotte, non sono stati sviluppati metodi universali ed efficienti per la profilazione e l’identificazione di siti di nitrazione proteica. Qui descriviamo un protocollo per l’arricchimento dei nitropeptidi utilizzando una reazione di riduzione chimica e l’etichettatura della biotina, seguita da spettrometria di massa ad alta risoluzione. Nel nostro metodo, i derivati nitropeptici possono essere identificati con alta precisione. Il nostro metodo presenta due vantaggi rispetto ai metodi precedentemente riportati. In primo luogo, l’etichettatura dimetila viene utilizzata per bloccare l’ammina primaria sui nitropeptidi, che può essere utilizzata per generare risultati quantitativi. In secondo luogo, per l’arricchimento viene utilizzato un’obbligazione disulfida contenente reagente NHS-biotina, che può essere ulteriormente ridotta e alchilata per migliorare il segnale di rilevamento su uno spettrometro di massa. Questo protocollo è stato applicato con successo al modello peptide Angiotensin II nel documento attuale.
Introduction
Nileggia dei residui di tirosina nelle proteine per formare 3-nitrotyrosine regola molti processi biologici. A causa delle diverse proprietà chimiche tra tirosina e 3-nitrotyrosine, una proteina nitrata può aver perturbato l’attività di segnalazione1,2. Pertanto, è importante sviluppare metodi in grado di arricchire e identificare i siti di nitrazione sulle proteine in modo efficiente. Poiché 3-nitrotyrosine è una modifica a bassa abbondanza sulle proteine rispetto ad altre forme di PTM, come la fosforolalazione e l’acetilazione, è difficile identificare siti di nitrazione endogeni direttamente da linee cellulari o campioni di tessuto. Tuttavia, è stata sviluppata la metodologia dell’utilizzo della spettrometria di massa (MS) per caratterizzare il modello di frammentazione del nitrotpeptide (ad esempio, ,han & Desiderio3), che getta le basi per nuovi metodi di nitroproteomica.
Attualmente, un passo di arricchimento seguito da MS è la strategia più potente per la profilazione nitropeptide4,5. I metodi di arricchimento possono essere classificati in due classi. Una classe si basa su anticorpi in grado di riconoscere 3-nitrotyrosine in modo specifico, mentre l’altra classe si basa sulla derivazione chimica che riduce un gruppo nitro a un gruppo di ammine4,5. Per il metodo basato sugli anticorpi, la colonna di affinità nitrotyrosine viene utilizzata per l’arricchimento, da cui il materiale eluito viene ulteriormente risolto e analizzato dall’alta risoluzione MS6,7. Per il metodo basato sulla derivazione chimica, i gruppi di ammine al n-terminus del peptide o della lisina devono essere bloccati nel primo passaggio da acetilazione, tag isobarici per quantitazione relativa e assoluta (iTRAQ), o tag di massa tandem (TMT) reagenti. Successivamente, viene utilizzato un riduttore per ridurre la nitrotilsina all’aminotirosofina seguita dalla modifica del gruppo di ammine appena formato, che include la legatura di biotina, la conversione di peptide sulfittra o altri tipi di sistemi di etichettatura8,9, 10,11. La maggior parte dei protocolli stabiliti finora si basano su proteine in vitro sovranitate, invece di proteine endogenamente nitonate.
Nel presente studio, una procedura modificata della derivazione chimica della nitrotyrosine è sviluppata per l’arricchimento e l’identificazione del nitropeptide, che mostra una maggiore sensibilità durante il rilevamento della SM ed è adatto allo scopo di quantificazione. Il nostro recente studio sull’utilizzo di questo metodo nei sistemi biologici ha identificato che la nizione della crosina di tirosina (LCK) specifica del linfocito (LCK) al Tyr394 da RNS prodotta da cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC) svolge un ruolo importante immunosoppressione del microambiente tumorale12. Pertanto, il nostro metodo di identificazione nitropeptide può essere applicato anche a campioni biologici complessi. Qui, descriviamo il nostro protocollo utilizzando il modello peptide Angiotensin II, di cui il modello di frammentazione è noto e ampiamente utilizzato negli studi nitroproteomici8,9,10,11, come esempio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descrive l’arricchimento e la profilazione del nitropeptide. Utilizzando Angiotensin II come peptide modello, abbiamo illustrato la procedura illustrata nella Figura 1. Dopo aver ottenuto il nitro-angiotensina II, l’ammina primaria sul peptide dovrebbe essere bloccata per evitare l’ulteriore coniugazione dell’ammina, che è uno dei passi più critici all’interno del protocollo. Nell’attuale protocollo, l’etichettatura dimetila viene utilizzata per bloccare le aree primarie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack è Principal Investigator; X.L. è un investigatore subrecipient). Questa pubblicazione è stata resa possibile con il supporto parziale di Grant Numbers KL2 TR002530 e UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) del National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. ha ricevuto il CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. è sostenuto dalle sovvenzioni per il cancro di base della Walther Cancer Foundation. X. W. è supportato dal National Natural Science Foundation of China General Program (Grant N. 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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