Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II
Summary
Die proteomische Profilierung von Tyrosin-Nitrat-Proteinen war aufgrund der geringen Häufigkeit der 3-Nitrotytyrosin-Modifikation eine anspruchsvolle Technik. Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für die Nitropeptidanreicherung und Profilierung unter Verwendung von Angiotensin II als Modell. Diese Methode kann für andere In-vitro- oder In-vivo-Systeme erweitert werden.
Abstract
Proteinnitration ist eine der wichtigsten post-translationalen Modifikationen (PTM) an Tyrosinrückständen und kann durch chemische Aktionen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Stickstoffarten (RNS) in eukaryotischen Zellen induziert werden. Die genaue Identifizierung von Nitrationsstellen auf Proteinen ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse im Zusammenhang mit Proteinnitration, wie Entzündungen, Alterung und Krebs. Da die nitratierten Proteine auch unter induzierten Bedingungen in Zellen von geringer Fülle sind, wurden keine universellen und effizienten Methoden zur Profilierung und Identifizierung von Proteinnitrationsstellen entwickelt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Nitropeptidanreicherung mit einer chemischen Reduktionsreaktion und Biotin-Etikettierung, gefolgt von hochauflösender Massenspektrometrie. In unserer Methode können Nitropeptidderivate mit hoher Genauigkeit identifiziert werden. Unsere Methode weist zwei Vorteile gegenüber den zuvor gemeldeten Methoden auf. Erstens wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um das primäre Amin auf Nitropeptiden zu blockieren, die verwendet werden können, um quantitative Ergebnisse zu generieren. Zweitens wird zur Anreicherung eine Disulfidbindung verwendet, die NHS-Biotin-Reagenz enthält, die weiter reduziert und alkyliert werden kann, um das Detektionssignal auf einem Massenspektrometer zu verbessern. Dieses Protokoll wurde im aktuellen Papier erfolgreich auf das Modellpeptid Angiotensin II angewendet.
Introduction
Die Nitration von Tyrosinrückständen in Proteinen zu 3-Nitrotyrosin reguliert viele biologische Prozesse. Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Eigenschaften zwischen Tyrosin und 3-Nitrotyrosin kann ein nitratiertes Protein die Signalwirkung1,2gestört haben. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die Nitrationsstellen auf Proteinen effizient anreichern und identifizieren können. Da 3-Nitrotyrosin eine geringe Häufigkeitsmodifikation auf Proteine im Vergleich zu anderen Formen von PTM, wie Phosphorylierung und Acetylierung, ist es schwierig, endogene Nitrationsstellen direkt aus Zelllinien oder Gewebeproben zu identifizieren. Dennoch wurde die Methode der Verwendung von Massenspektrometrie (MS) entwickelt, um das Fragmentierungsmuster von Nitrotpeptid zu charakterisieren (z. B. Zhan & Desiderio3), die den Grundstein für neue Methoden der Nitroproteomik legt.
Derzeit ist ein Anreicherungsschritt gefolgt von MS die stärkste Strategie für Nitropeptid Profilierung4,5. Die Anreicherungsmethoden können in zwei Klassen eingeteilt werden. Eine Klasse basiert auf Antikörpern, die 3-Nitrotyrosin spezifisch erkennen können, während die andere Klasse auf der chemischen Ableitung basiert, die eine Nitrogruppe auf eine Amingruppereduziert 4,5. Für die Antikörper-basierte Methode wird nitrotyrosin-Affinitätssäule für die Anreicherung verwendet, aus der das eluierte Material weiter gelöst und mit hochauflösendem MS6,7analysiert wird. Für die chemische Ableitungsmethode sollten die Amingruppen am N-Terminus des Peptids oder Lysins im ersten Schritt entweder durch Acetylierung, isobarere te-Tags für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) oder Tandemmassen-Tags (TMT)-Reagenzien blockiert werden. Als nächstes wird ein Reduzierer verwendet, um Nitrotyrosin zu Aminotyrosin zu reduzieren, gefolgt von einer Änderung der neu gebildeten Amingruppe, die Biotinligation, Sulphydrylpeptid-Konvertierung oder andere Arten von Tagging-Systemen8,9, 10,11. Die meisten der bisher etablierten Protokolle basieren auf in vitro übernitrateten Proteinen statt auf endogen nitratierten Proteinen.
In der vorliegenden Studie wurde ein modifiziertes Verfahren zur chemischen Ableitung von Nitrotyrosin zur Nitropeptidanreicherung und -identifikation entwickelt, das eine erhöhte Empfindlichkeit beim MS-Nachweis zeigt und für Quantifizierungszwecke geeignet ist. Unsere jüngste Studie, die diese Methode in biologischen Systemen verwendet, hat gezeigt, dass die Nitration der lymphozytenspezifischen Proteintyrosinkinase (LCK) bei Tyr394 von RNS, die aus myeloiden abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) hergestellt wird, eine wichtige Rolle bei der Immunsuppression der Tumormikroumgebung12. Daher kann unsere Methode der Nitropeptid-Identifikation auch auf komplexe biologische Proben angewendet werden. Hier beschreiben wir unser Protokoll anhand des Modells Peptid Sgiotensin II, von dem das Fragmentierungsmuster bekannt ist und in nitroproteomischen Studien 8,9,10,11als Beispiel weit verbreitet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll beschreibt hier die Nitropeptid-Anreicherung und Profilierung. Anhand von Angiotensin II als Modellpeptid haben wir das in Abbildung 1dargestellte Verfahren veranschaulicht. Nach Erhalt des Nitro-Angiotensin II sollte das primäre Amin auf dem Peptid blockiert werden, um die weitere Aminkonjugation zu vermeiden, die einer der kritischsten Schritte innerhalb des Protokolls ist. Im aktuellen Protokoll wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um die primären Aumine aus zwei Grü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack ist Principal Investigator; X.L. ist ein Subrecipient-Ermittler). Diese Publikation wurde mit teilweiser Unterstützung durch die Grant Numbers KL2 TR002530 und UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) vom National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award ermöglicht. X. L. ist Einträger des Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. wird von der Walther Cancer Foundation Unterstützt. X. W. wird vom National Natural Science Foundation of China General Program (Grant No. 817773047) unterstützt.
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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