Profilage et identification de Nitropeptide illustrépar Angiotensin II
Summary
Le profilage protéomique des protéines tyrosine-nitrated a été une technique provocante due à la basse abondance de la modification de 3-nitrotyrosine. Ici nous décrivons une approche nouvelle pour l’enrichissement et le profilage de nitropeptide en utilisant Angiotensin II comme modèle. Cette méthode peut être étendue à d’autres systèmes in vitro ou in vivo.
Abstract
La nitration protéique est l’une des modifications post-traductionnelles les plus importantes (PTM) sur les résidus de tyrosine et elle peut être induite par des actions chimiques d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et d’espèces d’azote réactif (RNS) dans les cellules eucaryotes. L’identification précise des sites de nitration sur des protéines est cruciale pour comprendre les processus physiologiques et pathologiques liés à la nitration de protéine, tels que l’inflammation, le vieillissement, et le cancer. Étant donné que les protéines nitrates sont de faible abondance dans les cellules, même dans des conditions induites, aucune méthode universelle et efficace n’a été mise au point pour le profilage et l’identification des sites de nitration des protéines. Ici nous décrivons un protocole pour l’enrichissement de nitropeptide en utilisant une réaction chimique de réduction et l’étiquetage de biotine, suivi de la spectrométrie de masse de haute résolution. Dans notre méthode, les dérivés du nitropéeptide peuvent être identifiés avec une grande précision. Notre méthode présente deux avantages par rapport aux méthodes précédemment rapportées. Tout d’abord, l’étiquetage du diméthyle est utilisé pour bloquer l’amine primaire sur les nitropéeptides, qui peut être utilisé pour générer des résultats quantitatifs. Deuxièmement, une liaison de disulfure contenant nhs-biotine réactif est utilisé pour l’enrichissement, qui peut être encore réduit et alkylé pour améliorer le signal de détection sur un spectromètre de masse. Ce protocole a été appliqué avec succès au modèle peptide Angiotensin II dans le document actuel.
Introduction
La nitration des résidus de tyrosine dans les protéines pour former 3-nitrotyrosine régule de nombreux processus biologiques. En raison des différentes propriétés chimiques entre la tyrosine et la 3-nitrotyrosine, une protéine nitrated peut avoir perturbé l’activité de signalisation1,2. Par conséquent, il est important de développer des méthodes qui peuvent enrichir et identifier efficacement les sites de nitration sur les protéines. Comme la 3-nitrotyrosine est une modification de faible abondance sur les protéines par rapport à d’autres formes de PTM, comme la phosphorylation et l’acétylation, il est difficile d’identifier les sites de nitration endogènes directement à partir de lignées cellulaires ou d’échantillons de tissus. Néanmoins, la méthodologie d’utilisation de la spectrométrie de masse (MS) pour caractériser le modèle de fragmentation du nitrotpeptide a été développée (par exemple, Zhan et Desiderio3), qui jette les bases de nouvelles méthodes de nitroprotéomique.
Actuellement, une étape d’enrichissement suivie par la SP est la stratégie la plus puissante pour le profilage nitropeptide4,5. Les méthodes d’enrichissement peuvent être classées en deux classes. Une classe est basée sur des anticorps qui peuvent reconnaître 3-nitrotyrosine spécifiquement, tandis que l’autre classe est basée sur la dérivation chimique qui réduit un groupe nitro à un groupe d’amine4,5. Pour la méthode basée sur les anticorps, colonne d’affinité nitrotyrosine est utilisé pour l’enrichissement, à partir de laquelle le matériau éluesté est encore résolu et analysé par haute résolution MS6,7. Pour la méthode à base de dérivation chimique, les groupes d’amine au N-terminus du peptide ou de la lysine devraient être bloqués dans un premier temps soit par acétylation, balises isobares pour quantitation relative et absolue (iTRAQ), ou réagents de masse tandem (TMT). Ensuite, un réducteur est utilisé pour réduire la nitrotyrosine à l’aminotyrosine suivie par la modification du groupe amine nouvellement formé, qui comprend la ligature de la biotine, la conversion de peptide sulphydryl, ou d’autres types de systèmes de marquage8,9, 10,11. La plupart des protocoles établis jusqu’à présent sont basés sur des protéines in vitro sur-nitrated, au lieu de protéines endogènes nitrates.
Dans la présente étude, une procédure modifiée de la dérivation chimique de la nitrotyrosine est développée pour l’enrichissement et l’identification du nitropéptide, qui montre une sensibilité accrue pendant la détection de la SP et convient à la quantification. Notre étude récente utilisant cette méthode dans les systèmes biologiques a identifié que la nitration de la tyrosine kinase de protéine lymphocyte-spécifique (LCK) à Tyr394 par RNS produit à partir des cellules suppressrices myéloïdes dérivées (MDSCs) joue un rôle important dans le immunosuppression du microenvironnement de tumeur12. Par conséquent, notre méthode d’identification de nitropeptide peut être appliquée aux échantillons biologiques complexes aussi bien. Ici, nous décrivons notre protocole en utilisant le modèle peptide Angiotensin II, dont le modèle de fragmentation est connu et largement utilisé dans les études nitroprotéomiques8,9,10,11, à titre d’exemple.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici l’enrichissement et le profilage des nitropéptides. En utilisant Angiotensin II comme peptide modèle, nous avons illustré la procédure montrée dans la figure 1. Après l’obtention de la nitro-Angiotensine II, l’amine primaire sur le peptide doit être bloquée pour éviter l’autre conjugaison de mine, qui est l’une des étapes les plus critiques dans le protocole. Dans le protocole actuel, l’étiquetage du diméthyle est utilisé pour bloquer les amines primaire…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par l’American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack est chercheur principal; X.L. est un enquêteur sub-récipiendaire). Cette publication a été rendue possible grâce au soutien partiel de Grant Numbers KL2 TR002530 et UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) des National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. est récipiendaire du prix Du jeune enquêteur CTSI de l’Indiana. S. F. est soutenu par les subventions de la Walther Cancer Foundation Advancing Basic Cancer. X. W. est soutenu par le National Natural Science Foundation of China General Program (Grant No. 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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