Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II
Summary
Proteomic profilering van tyrosine-nitraat eiwitten is een uitdagende techniek vanwege de geringe overvloed van de 3-nitrotyrosine modificatie. Hier beschrijven we een nieuwe aanpak voor nitropeptide verrijking en profilering met behulp van angiotensine II als model. Deze methode kan worden uitgebreid voor andere in vitro -of in vivo -systemen.
Abstract
Eiwit nitraat is een van de belangrijkste post-translationele modificaties (PTM) op tyrosine residuen en kan worden geïnduceerd door chemische acties van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en reactieve stikstof soorten (RNS) in eukaryote cellen. Nauwkeurige identificatie van nitratie plaatsen op proteïnen is essentieel voor het begrip van de fysiologische en pathologische processen met betrekking tot eiwit nitraat, zoals ontsteking, het verouderen, en kanker. Aangezien de nitraat proteïnen van lage overvloed in cellen zelfs onder veroorzaakte voorwaarden zijn, zijn geen universele en efficiënte methodes ontwikkeld voor het profileren en de identificatie van eiwit nitraat plaatsen. Hier beschrijven we een protocol voor nitropeptide verrijking met behulp van een chemische reductie reactie en biotine etikettering, gevolgd door een hoge resolutie massaspectrometrie. In onze methode, nitropeptide derivaten kunnen worden geïdentificeerd met een hoge nauwkeurigheid. Onze methode vertoont twee voordelen ten opzichte van de eerder gerapporteerde methoden. Eerst wordt dimethyl labeling gebruikt om de primaire amine op nitropeptides te blokkeren, wat gebruikt kan worden om kwantitatieve resultaten te genereren. Ten tweede, wordt een disulfide band die NHS-Biotine reagens bevat gebruikt voor de verrijking, die verder kan worden verminderd en Gealkyleerde om het opsporings signaal op een massaspectrometer te verbeteren. Dit protocol is met succes toegepast op het model peptide angiotensine II in het huidige papier.
Introduction
De nitraat van tyrosine residuen in proteïnen aan vorm 3-nitrotyrosine regelt vele biologische processen. Wegens de verschillende chemische eigenschappen tussen tyrosine en 3-nitrotyrosine, kan een nitraat proteïne verstoord signalerende activiteit1,2hebben. Daarom is het belangrijk om methoden te ontwikkelen die nitraat sites op eiwitten efficiënt kunnen verrijken en identificeren. Als 3-nitrotyrosine is een lage overvloed modificatie op eiwitten in vergelijking met andere vormen van PTM, zoals phosphorylation en acetylatie, is het een uitdaging om endogene nitratie plaatsen direct te identificeren van de cel lijnen of weefselmonsters. Toch is de methodologie van het gebruik van massaspectrometrie (MS) om het fragmentatie patroon van nitrotpeptide te karakteriseren is ontwikkeld (bijvoorbeeld, & inde richting van de van de nitroproteomics.
Momenteel is een verrijking stap gevolgd door MS is de meest krachtige strategie voor nitropeptide profilering4,5. De verrijkings methodes kunnen in twee klassen worden geclassificeerd. Een klasse is gebaseerd op antilichamen die kunnen herkennen 3-nitrotyrosine specifiek, terwijl de andere klasse is gebaseerd op de chemische afleiding die een Nitro groep vermindert tot een aminegroep4,5. Voor de antilichaam-gebaseerde methode, nitrotyrosine affiniteit kolom wordt gebruikt voor de verrijking, waaruit de geëlueerd materiaal wordt verder opgelost en geanalyseerd door hoge resolutie MS6,7. Voor de chemische afleiding-gebaseerde methode, de amine groepen op de N-Terminus van de peptide of lysine moet worden geblokkeerd in de eerste stap, hetzij door acetylatie, isobaar Tags voor relatieve en absolute kwantificatie (iTRAQ), of tandem massa Tags () reagentia. Vervolgens wordt een reducer gebruikt om nitrotyrosine te verminderen tot aminotyrosine gevolgd door het wijzigen van de nieuw gevormde aminegroep, die biotine afbinding, sulphydryl peptide conversie, of andere vormen van tagging systemen omvat8,9, 10,11. De meeste van de tot nu toe vastgestelde protocollen zijn gebaseerd op in vitro over-nitrated eiwitten, in plaats van endogene nitraat eiwitten.
In de huidige studie, een gewijzigde procedure van de chemische afleiding van nitrotyrosine is ontwikkeld voor de nitropeptide verrijking en identificatie, waaruit blijkt verbeterde gevoeligheid tijdens MS detectie en is geschikt voor kwantificering doel. Onze recente studie in dienst van deze methode in biologische systemen vastgesteld dat de nitraat van lymfocyten-specifieke eiwit tyrosine kinase (LCK) op Tyr394 door RNS geproduceerd uit myeloïde-afgeleide suppressor cellen (MDSCs) speelt een belangrijke rol in de immunosuppressie van de tumor microenvironment12. Daarom kan onze methode van nitropeptide identificatie ook worden toegepast op complexe biologische monsters. Hier beschrijven we ons protocol met behulp van het model peptide angiotensine II, waarvan de versnippering patroon is bekend en op grote schaal gebruikt in nitroproteomic studies8,9,10,11, als een voorbeeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschrijft hier de nitropeptide verrijking en profilering. Met behulp van angiotensine II als het model peptide, illustreerden we de procedure weergegeven in Figuur 1. Na het verkrijgen van de Nitro-angiotensine II, moet de primaire amine op het peptide worden geblokkeerd om de verdere amine vervoeging te voorkomen, dat is een van de meest kritieke stappen binnen het protocol. In het huidige protocol wordt dimethyl labeling gebruikt om de primaire aminen om twee redenen te blokk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse kanker maatschappij institutioneel onderzoek Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon stack is Principal Investigator; X.L. is een subontvanger onderzoeker). Deze publicatie werd mogelijk gemaakt met gedeeltelijke steun van toelage aantallen KL2 TR002530 en UL1 TR002529 (A. de, PI) van de nationale instituten van gezondheid, nationaal centrum voor de bevordering van translationele wetenschappen, de klinische en vertaalprijs van de wetenschappen. X. L. is een ontvanger van Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. wordt ondersteund door Walther Cancer Foundation oprukkende basis kanker subsidies. X. W. wordt gesteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van het algemene programma van China (toelage nr. 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
