מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד KDM1A מטרת האירוסין בתוך תא אנושי או בעלי חיים, רקמות או דגימות דם שטופלו עם KDM1A מעכבי. הפרוטוקול משתמש תיוג כימית של האנזים KDM1A חינם וקוונפיקציה ישירה של הכיבוש היעד באמצעות החיסונית מבוססי כימופי מבוסס והוא יכול לשמש במחקרים פרה-קליניים וקליניים.
Abstract
הערכה של מעורבות היעד, המוגדרת כאינטראקציה של תרופה עם החלבון שהוא תוכנן עבורו, היא דרישה בסיסית לפרשנות הפעילות הביולוגית של כל תרכובת בתחום הפיתוח של הסמים או בפרויקטי מחקר בסיסיים. ב אפיגנטיקה, היעד התחייבות מוערך לרוב על ידי ניתוח של סמנים proxy במקום מדידת האיחוד של המתחם ליעד. במורד הזרם הביולוגי שנותחו כוללים את אפנון סימן האבן או משתנה הביטוי הגנטי. KDM1A הוא ליזין דמטקלז המסיר קבוצות מתיל מH3K4 מונו ודימתיל, שינוי המשויך להשתקה הביטוי הגנטי. אפנון סמני ה-proxy תלויה בסוג התא ובפונקציה של האיפור הגנטי של התאים שנחקרו, אשר יכול להפוך פרשנות והשוואת מקרה הצלב די קשה. כדי לעקוף בעיות אלה, פרוטוקול רב-תכליתי מוצג כדי להעריך את השפעות המינון ואת הדינמיקה של התחייבות ישירה KDM1A היעד. התיקון תיאר עושה שימוש KDM1A chemoprobe כדי ללכוד ולכמת אנזים עצורים, ניתן להחיל באופן נרחב על תאים או דגימות רקמות ללא צורך שינוי גנטי, יש חלון מצוין של גילוי, והוא יכול לשמש הן עבור מחקר בסיסי וניתוח של דגימות קליניות.
Introduction
ליזין מסוים demethylase 1 (KDM1A)1 הוא demethקלז מעורב בשליטה של תמלול גנים. חלבון זה התפתחה כיעד תרופתי מועמד2 באונקולוגיה; כולל לוקמיה מיאלואידית חריפה3 (AML), מיאלודיספלסטית סינדרום (MDS)4, myelofibrosis (MF)5,6, תא קטן סרטן ריאות (sclc)7; ב מחלת התאים המגל (scd)8,9, ו ב מחלות מערכת העצבים המרכזית כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה (MS); ובתוקפנות10.
רוב התרכובות הKDM1A מעכבות בהתפתחות הקלינית הן נגזרות ציקלופרופילטין ומעכבים את החלבון באמצעות כריכה בעלת כריכת שינוי בעלת הפלאונטי (באופנה). עיכוב של KDM1A גורם ביטוי גנים שינויים, אבל שינויים אלה משתנים מאוד על פני רקמות, סוגי תאים, או מחלות מקרים. עיכוב של KDM1A גם משנה את הסימנים היסטון12, אך שינויים אלה מיוצרים בדרך כלל באופן מקומי באתר מסוים בגנום, והם שוב, רקמות מאוד תאים ספציפיים.
הפרוטוקול פותח כדי למדוד באופן ישיר התחייבות KDM1A היעד בדגימות ביולוגיות והוא ממוטב לשימוש עם מעכבי נגזרות ציקלוקילאמין. הגישה מבוססת על טכנולוגיית אליסה ומנתחת, במקביל, סה כ חופשי (כלומר לא מאוגד על ידי מעכב) KDM1A בתמצית חלבון יליד ממדגם ביולוגי בתוך שיטת שלב מוצק. כצעד הראשון, המדגם הביולוגי הוא להיות לאחר הנוכחות של KDM1A ביולוגית כימית סלקטיבית OG-88113,14, נגזר KDM1A מעכב סלקטיבי אורי-1001 (i, מעכב), חזק מעכבי של KDM1A במחקר קליני פיתוח לטיפול במחלות אונקולוגי. לKDM1A יש IC50 של 120 nM וכולל moiety כריכת אופנה מקושר פוליאתילן ביולוגי גליקול (יתד)-זנב. הגלימה מקושרת בלעדית לKDM1A החופשי, אבל לא לKDM1A המדכא במדגם. לאחר הכריכה כימית, KDM1A המכיל מתחמי במדגם נלכדים על צלחות microtiter עם משטח מצופה streptavidin כדי לקבוע KDM1A חינם, או על צלחות מצופה עם נוגדן לכידת מונושבטיים נגד KDM1A כדי לקבוע את סך KDM1A. לאחר שטיפת, שתי הצלחות הן מודקות עם נוגדן זיהוי anti-KDM1A, שטף שוב, ו-מודעם עם משני HRP מצוח חמור נגד ארנב IgG נוגדן לאיתור באמצעות מצע וכימות זורח על ידי מדידת יחסי יחידות אור (RLU) בלומטר (איור 1).
איור 1. הסכמה של אליסה האנזים מקושר כימית מערכת מערכת לKDM1A יעד התחייבות: A) ההגדרה של סה כ KDM1A באמצעות סנדוויץ ‘ אליסה ו B) קביעת הKDM1A בחינם באמצעות כימול אליסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
עקומה סטנדרטית כלולה בשתי צלחות ה-אליסה כדי לאמת את היניאריות של כל אחד מהסטנדרטים. הקביעה של התחייבות KDM1A יעד בכל מדגם מחושבת לאחר מכן כערך יחסי לדגם טרום-מינון או טיפול בכלי רכב.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן פותחה כדי למדוד ישירות KDM1A היעד באמצעות רומן KDM1A chemoprobe ללכוד מבוסס אליסה. השיטה אומתה על קווי הגוף האנושי התרבותי ודגימות vivo לשעבר מן האדם, עכברוש ועכבר בבון (כולל PBMCs, ריאות, המוח, העור, גידולים), אבל יכול להיות מיושם בקלות על מינים אחרים שבו KDM1A נוגדן היעד אפיסקופים ו קטלי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה ממומן על ידי Oryzon גנומיקה. דרום אמריקה, הופמן-לה רוש, ונתמך באופן חלקי על ידי CIIP-20152001 ו RETOS תוכנית שיתוף פעולה RTC-2015-3332-1.
Materials
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
