Tahmin içinde Vivo Payloads bir kan-beyin tümör-engel bir tabak içinde kullanarak teslim

Hayvan deneyleri hayvan deneyleri, bölge, Güney Finlandiya (ESAVI/6285/04.10.07/2014) için Komitesi tarafından kabul edildi. 1. BBTB taklit eder kurulması Not: Hücre kültür orta ve takviyeleri tablo malzemelerinayrıntılı olarak açıklanmıştır. Astrocytes hazırlanmasıNot: Aşağıdaki birimler 10 cm Petri kabına veya bir T75 hücre kültür şişesi için uygundur. Steril hücre kültür başlık altında dikkatle kültürlü astrocytes 5 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. Yavaşça bir vakum pompası kullanarak PBS atmak ve hücre ayrılma reaktif 5 min için 2 mL ekleyin (37 °C, Malzemeler tablogörmek) hücreleri ayırmak için. Mikroskop altında hücre dekolmanı denetleyin. 5 dk, kuluçka hücreleri üzerinde stres sınırlamak için fazla olamaz. 10 mL steril tam astrocyte hücre kültür orta (ABM +) hücre ayrılma reaktif aktivitesini inhibe gemi ekleyin. Steril serolojik damlalıklı müstakil hücreleri gemiden bir steril 15 mL tüp aktarmak için kullanın. Hücre süspansiyon 250 rcf adlı 3 dk santrifüj kapasitesi (hızlanma: 9 rcf/s, yavaşlama: 5 rcf/s), oda sıcaklığında (RT). Bu arada, (bkz: Malzemeler tablo) ekler hazırlamak: steril forseps kullanarak, ekler (şekil 1A) kadar beyin tarafı ile steril 6-şey plaka (şekil 1B) kapağını yerleştirin. Önceden plaka baş aşağı ekler üzerinde dokunmadan veya ekler işlemi sırasında taşımadan yerleştirilebilir doğrulayın.Not: Ekler uygun yerleşim membran ve kuyunun astrocyte süspansiyon tuzak arasında sağlayan. Bir kez centrifuged, dikkatle süpernatant hücre süspansiyon üzerinden atmak; astrocyte Pelet resuspend s duvar 5 x 1 ml ABM + yavaşça Pelet tüp’resuspending tarafından. Aşırı stres hücrelerde sınırlamak için hücrelerin pipetting kaçının. Hücreleri saymak ve 1.5 x 400 µL ABM 105 hücrelerde hücre süspansiyon yoğunluk ayarlamak +/ yerleştirin. Hücre süspansiyon beyin tarafı ucun’ortasında yer s membran (şekil 1B) ve çok dikkatli bir şekilde steril damlalıklı ucu ile kılcal kuvvet kullanarak yayıldı. Membran özellikle kırılgan olduğu gibi doğrudan temastan kaçının. Ekler beyin tarafı ile hala yukarı, 6-şey plaka geri ekler üzerinde yerleştirin. Bu hücre süspansiyon membran ve gerçek kuyunun (şekil 1 c) arasında sıkışıp sağlar. Astrocytes membran üzerinde homojen yayılmasını engeller gibi hava kabarcıkları hücre süspansiyon kaçının. Plaka ve ekler, beyin yüzü yukarı da kuluçka makinesine yerleştirin (37 °C % 5 ile CO2) hücre adezyon (insan birincil astrocytes) en az 2 h (fare ölümsüzleştirdi astrocytes) ve en fazla 6 s izin vermek için.Not: Ekler baş aşağı tutulur, hücre adezyon görselleştirme mikroskop altında mümkün değildir. Bu nedenle, bir ayrı normal hücre kültür gemi tohum ve hücre adezyon gemi içinde zamanla kontrol etmek için tavsiye edilir. Dikkatli zaman membranlar zarar sonuçları güvenilmez olduğu gibi membran manipülasyon şarttır. Kuluçka süresi sonunda, hücre süspansiyon sızıntıları tohumlama alanı dışında yokluğu doğrulayın ve ekler sızan olmaları durumunda atın. 6-şey plaka (şekil 1A) kan tarafa şimdi olacak ekler ile normal konumuna döner. ABM + 2.6 mL her şey için ekleyin. Tam astrocyte orta 2.5 mL her sokmak içine dökün ve plaka da kuluçka makinesine koyun (37 °C % 5 ile CO2). Endotel hücreleri hazırlanmasıNot: Fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri için (bEND3), hücrelerin en iyi sıkı kavşak protein ifade deneme günü tetikleme maksimal hücre-hücre kişiler sağlamak için % 100 izdiham ulaşmalıdır. Astrocytes varlığı için sıkı kavşak protein ifadesi bu hücreler için gerekli olduğu gibi bu insan göbek damar endotel hücreleri (HuAR2T) için geçerli değildir. Daha önce astrocytes (Adım 1.1.1 ve 1.1.2.) için açıklandığı gibi devam edin. Bir kez centrifuged, dikkatle süpernatant atmak; endotel hücre Pelet resuspend s duvar 5 x 1 ml tam endotel hücre kültür orta yavaş yavaş hücre süspansiyon Tube’pipetting tarafından (EBM +). Aşırı stres hücrelerde sınırlamak için hücrelerin pipetting kaçının. Hücreleri saymak ve hücre süspansiyon yoğunluk 2.5 ml 2 x 105 hücrelere ayarlamak/serum (EBM-) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü yoksun endotel hücre kültür ortamının insert-A (VEGF-A). Ekler içeren plaka almak, dikkatli bir şekilde kan yan ortamından atmak ve endotel hücre süspansiyon 2.5 mL ile değiştirin. Plaka da kuluçka için dönmek (37 °C % 5 ile CO2) ve gecede endotel hücre membran için uymaları için bırakın. Ertesi gün, her şey için prewarmed serum-Alerjik astrocyte orta (ABM-) 3 mL aktararak steril bir 6-şey tabak hazırlamak. Ekler steril Forseps ile işleme tarafından dikkatle endotel tam orta kan yakasından atmak, INSERT ABM-içeren yeni plaka yerleştirin ve EBM – 2.5 mL ekleyin.Not: EBM – endotel bariyer kurulması için kritik kullanmaktır (Lütfen tartışma bölümüne bakın). Ekler da kuluçka makinesine bırakın (37 °C % 5 ile CO2) en az fiziksel rahatsızlık ve endotel membran, üretimi sağlayan ısı farklılıkları 5 gün ile astrocyte kişiler ile endotel hücreleri ve sonunda, BBTB formasyonu taklit. Tümörü hücre kültürleri transferinde gün orta yerine (lütfen 1.4 bölümüne bakın). (İsteğe bağlı) BBTB kopyalama geçirgenliği ölçümü Küçük molekül ağırlıklı floresan boya sodyum floresein (Na-Fl) pasif Difüzyon ekler beyin tarafına kandan zamanla geçirgenlik değerleri aşağıdaki formüle göre hesaplanması sağlar:Burada, dFdeiyi hücre kültür orta autofluorescence değeri eksi belirli bir zaman noktasında ölçülen Floresans değeri dT süreyi saniye olarak, A kare santimetre ve bariyer yüzeydir dFEkle floresan değeri eksi orta autofluorescence değeri aynı zamanda noktada eklemek içinde ölçülür). Orta 100 µL kan ve BBTB taklit beyin kenarlarında toplamak ve her biri sonraki Floresans ölçümler için ayrı bir düz oturaklı, siyah 96-şey plaka transfer. Düz medya boş autofluorescence düzeltmek için kullanın. Na-Fl kuyu başına 2.5 mL hazırlamak (50 µM) EBM. Na-Fl çözüm ile 37 ° c prewarm Ortamı ekler kan tarafındaki orta yerine en kısa zamanda Na-FL başlatmak ve sayaç içeren medya ile değiştirin. Dikkatli bir şekilde medya 100 µL kan ve 5, 30, 60 adresindeki ekler beyin tarafında toplamak ve 120 dk. Transfer siyah 96-şey plaka kuyu ayırmak için her örnek. Buna göre her iki taraf arasında güç dengesini korumak için ekler üzerinden toplanan ortamı değiştirin. Ekler İnkübatör arasındaki ısı farklılıkları en aza indirmek için her örnek koleksiyon geri koyun. Floresans 480/560 ayarla filtresi ile plaka okuyucu kullanarak toplanan örnekleri üzerinden ölçmek nm (uyarma ve emisyon, sırasıyla).Not: Floresans beyin tarafından gelen 5 dk zaman noktada neredeyse mümkün değildir. Yüksek değerler için boş göre bir sızıntı belirtmek / zarar Ekle’s membran veya bariyer; Bu nedenle, daha fazla analizleri bunlardan hariç. BBTB için beklenen Na-Fl geçirgenlik değerleri 10-6 cm/s aralığı (Tablo 1) için 10-5 olmalıdır. Tümörü hücreleri hazırlanmasıNot: Hasta kaynaklı glioblastoma küreler burada kullanılmasına rağmen aşağıdaki iletişim kuralı yapışık, piyasada bulunan glioblastoma hücreler gibi U – 87 MG için kolayca adapte edilebilir. İsteğe bağlı olarak, dört yuvarlak steril borosilikat coverslips ayirt görüntüleme için yer (ø 0.9 cm) 2 mL Poli-D-lizin (% 0.01) içeren bir 6-şey plaka kuyuda başına. 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya. Bu arada, dikkatli bir şekilde tümör küreler bir 15 mL steril tüp steril serolojik damlalıklı kullanarak hücre kültür gemiden aktarın. Tümör küreler 250 rcf adlı 3 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak, yavaşça küreler 1 mL bFGF/EGF-ücretsiz (GBM) gliyom hücre ve orta resuspend ve hücreleri saymak. Yaklaşık 104 küre/ml (105 hücre/mL) GBM-hücre yoğunluğu ayarlayın. Poli-D-lizin kuyulardan atmak ve yıka steril PBS ile 3 x. Plaka 3 mL/de tümör küresel süspansiyon, tohum ve ekler BBB taklit ile tümör hücre süspansiyon üzerinde transfer. Gecede kuluçkaya (37 °C % 5 ile CO2) tümör iki testin kan ve beyin arasındaki denge sağlamak için. Ertesi gün, kan yan medyada EBM-molekülleri/uyuşturucu/nano tanecikleri ile ilgi takıma değiştirin. Önceki bölümde açıklandığı gibi örnekleri doğrudan miktar için zaman içinde toplanır. Hücreleri floresan görüntüleme için kesin zaman noktada sabit (2,1 ve 2,2 bölümlerine bakınız). 2. yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme BBTB Not: %4 paraformaldehyde (PFA, pH 7.4, BBTB REPLICATE başına 6 mL) her zaman PBS taze hazırlanır. Buz üstünde tutun. Uyarı: İngiltere’de yılın kanserojen. Nitril eldiven kimyasal duman başlık altında çözüm hazırlamak ve İngiltere’de yılın işlemek için kullanın. Sıkı kavşak proteinlerin BBTB endotel ifade Durulama zar buz gibi PBS ile her iki (3 x 5 dk, 2.5 mL için/INSERT, 3 mL/de). PBS atmak ve 3 mL ve buz gibi %4 2.5 mL ekleyin PFA kuyu ve INSERT, anılan sıraya göre. 10 dk. atma ise buz üzerinde kuluçkaya (kurum’göre s tehlikeli kimyasal elden çıkarma) ve RT (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) 3 x PBS ile durulayın.Not: Bir kez sabit, örnekleri PBS (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) bir hafta boyunca 4 °C depolanabilir. Bir pamuklu çubukla ekleme beyin yüzeyini silin ve astrocytes kaldırmak için kullanın. Keskin bir neşter kullanarak dikkatle membran dört eşit parçalar halinde kesilmiş bir haç oluşturan iki dikey kesim yaparak. Ardından, neşteri nerede membran Ekle duvarına bitişik yere ekleyin ve dört örnekleri kurtarmak için diğer el ile ekleme döndürün. İyi cımbız kullanarak, dikkatle her örnek PBS/iyi, 200 µL kan tarafı yukarı her iyi ile içeren bir 24-şey plaka aktarın. Membranlar ile % 10 fetal sığır serum PBS içinde (için 30 dk, RT, 200 µL/iyi) engelleyin. 1° antikor çözüm sıkı kavşak immunostaining için proteinler (şekil 1 d) hazırlamak (zonula occludens-1, claudin-5; Malzemeler tabloiçin bakınız) çözüm/iyi engelleme 200 µL içinde. İsteğe bağlı olarak, trombosit endotel hücre adezyon molekülü (PECAM1 ya da CD31; Malzemeler tabloiçin bakınız) karşı her sıkı kavşak antikor çözüm için yükseltilmiş bir antikor ekleyerek endotel hücre kimliği doğrulanır. Engelleme çözüm atmak ve birincil antikorlar’ O/N 4 °c ile kuluçkaya Ertesi gün, birincil antikorlar atmak ve PBS 200 µL ile yıka (RT, 5 min için 3 x). Onları uygun species-specific fluorophore Birleşik ikincil antikorlar ile kuluçkaya (1:500 seyreltme, 200 µL/iyi, engelleme çözümde seyreltilmiş; Malzemeler tabloiçin bakınız) için 2 h RT. İkincil antikorlar atmak, durulama PBS 200 µL ile (3 x 5 dk RT az için). PBS kaldırmak ve bir 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) çözüm 1 µg/mL saf distile H2O (dH2O; 200 µL/iyi malzemeler tablo için bakınız; son bir konsantrasyon kullanarak hücre çekirdeği counterstain ). 7 dk RT. Kaldır, DAPI kuluçkaya ve membranlar 3 yıkama x dH2O ile (200 µL/de). Bir damla montaj orta yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) cam mikroskop Slayt üzerindeki. İyi cımbız kullanarak, dikkatle membran kuyudan al ve yönlendirmesini tutmak, dH2O fazlalığı çıkarın ve montaj orta teslimi yerleştirin. Montaj orta membran üstüne başka bir damla ekleyin ve dikkatli bir borosilikat cam ile kaplayın. Hapsolmuş hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. 4 °C ve ışıktan uzak örnekleri confocal mikroskobu gözlemler kadar saklayın.Not: Astrocyte boyama yapılabilir beyin tarafı yukarı ile seçilen astrocyte özgü antikor kullanımı ile 24-şey plaka membranlar parçaları koyarak (örneğin, gliyal fibrillary asit protein [GFAP’nin] karşı yönetmen) (şekil 1E ). BBTB floresan nanopartikül transcytosis algılamak için boyama Canlı hücre lysosome etiketleme gerçekleştirmek (örneğin, floresan kullanarak probları [ Tablo reçetesigörmek]). Lysosome floresan boya çalışma konsantrasyonu 50, seyreltik prewarmed EBM-nM (2.5 mL/Ekle) veya prewarmed ABM – 75 mm (3 mL/de) lysosome için etiketleme endotel hücreleri ve astrocytes, anılan sıraya göre. 45 dk için hücreleri kuluçkaya (37 °C % 5 ile CO2); sonra 3 x buz gibi PBS (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) ile yıkayın. PBS atmak ve 3 mL ve buz gibi %4 2.5 mL ekleyin PFA kuyu ve INSERT, anılan sıraya göre. Onları ise 10 dk. atma için buz üzerinde kuluçkaya ve hücreleri 3 durulama x PBS (at RT, 2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) ile.Not: Bir kez sabit örnekleri PBS (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) bir hafta boyunca 4 ° C’de depolanabilir. PBS kaldırmak ve bir son konsantrasyonu dH2O 1 µg/ml (1 mL/INSERT, 1 mL/da) bir DAPI çözüm kullanarak hücre çekirdeği counterstain. Onları 7 dk RT. Kaldır, DAPI kuluçkaya ve membranlar 3 yıkama x dH2O (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) ile. Dikkatle membran kesmek, dH2O fazlalığı çıkarın ve montaj orta bir damla üzerinde yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) cam mikroskop Slayt üzerindeki. Membran öbür ucunda montaj orta başka bir damla ekleyin ve dikkatle bir borosilikat cam ile kaplayın. Hapsolmuş hava kabarcıkları kaçının. 4 °C de örnekleri depolamak ve ışıktan confocal mikroskobu görüntüleme kadar korumalı tutun. Tümör hücreleri floresan boyama İyi cımbız kullanarak, tümör küreler buz gibi PBS ile dolu bir 24-şey plaka içeren yuvarlak coverslips dikkatli bir şekilde aktarın. Floresan lysosome sondalar 75 at kullanarak etiketleme canlı hücre lysosome devam prewarmed GBM-nM (200 µL/de). Örnekleri için 45 dk kuluçkaya; o zaman, yıka buz gibi PBS ile 3 x (200 µL/de). PBS atmak ve buz gibi İngiltere’de yılın iyi başına 200 µL ekleyin. 10 dk. atma ise buz üzerinde kuluçkaya ve durulama örnekleri 3 x (RT) adlı PBS ile.Not: Kez sabit örnekleri-ebilmek var olmak stok içinde PBS (200 µL) bir hafta boyunca 4 ° C’de. PBS kaldırmak ve hücre çekirdeği 1 µg/ml dH2O son bir konsantrasyon, DAPI çözüm kullanarak counterstain (200 µL/de). Onları 7 dk RT. Kaldır, DAPI kuluçkaya ve coverslips 3 yıkama x dH2O ile (200 µL/de). İyi cımbız kullanarak, coverslip alın, dH2O fazlalığı kaldırmak ve montaj orta bir damla üzerinde yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) cam mikroskop Slayt üzerindeki. Herhangi bir hava kabarcıkları entrapping kaçının. 4 °C de örnekleri depolamak ve ışıktan confocal mikroskobu gözlemler kadar korumalı tutun. 3. in Vivo karşılaştırmalı çalışma Sodyum floresein Difüzyon BBB yoluyla in situ kayıt Fizyolojik bir çözümde 50 nM Na-Fl çözümünün 150 µL hazırlayın. Çözüm 37 °C intravenöz teslimat üzerine tutun. Bir fare bir ketamin/xylazine kokteyl (100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine PBS içinde 300 µL) mayi enjeksiyonu ile anestezi. Derin anestezi kurulduktan sonra hayvan, vücut ısısını korumak için Isıtma yastığını yerleştirin.Not: On-hafta-yaşlı kadın deniz Tıbbi Araştırma Enstitüsü (NMRI) çıplak immün fare Şekil 2′ de sunulan verileri elde etmek için kullanılmaktadır. Ancak, bu iletişim kuralını immün ve immün fareler için adapte olduğunu. ‘Bilim adamı anestezi/analjezi yöntemdir s takdirine bağlı olarak. Ancak, önemli ölçüde BBB geçirgenliği18arttıkça inhalasyon anestezi isoflurane gibi tavsiye edilmez. Stereotaksik bir çerçeve üzerinde fareyi getirin ( Tablo reçetesigörmek) ve bağ doku, kafatası ortaya çıkarmak için iyi cımbız kullanarak nazik dilacerations tarafından takip iyi makas ile kafa derisi boyuna bir kesi gerçekleştirmek. Dairesel hareketler ile iyi bir microdrill kullanarak, ø 0.3 mm dairesel parça kafatasının sol veya sağ parietal kemik kaldırın. Aşırı sondaj sırasında ve temel meninjeal doku ve kan damarları zarar önlemek için kafatası parçası kaldırma sırasında dikkatli olun. Fizyolojik çözüm maruz doku üzerinde bir damla bir yer. İki çift iyi forseps kullanarak, beyin korteksi erişmek için meninjeal doku dikkatli bir şekilde çıkarın. Beyin dokusu hiç hava ile doğrudan temas halinde olmalıdır.Not: Meninjeal yaralanmalara karşı küçük kanama durdu hematolojik sünger kullanarak ( Malzemeler tabloiçin bakınız). Bir kez meninjeal doku kaldırılır ve korteks tamamen maruz, korteks ve ø 0,5 mm borosilikat coverslip arasında fizyolojik çözüm bir damla tuzağa. Cyanoacrylate tutkal bir damla ile gözlem alanı güvenli ( Malzemeler tabloiçin bakınız) coverslip bir iğne ile yayıldı. İzin için 1 dk kuru tutkal. İmplante edilebilir kateter kuyruk ven enjeksiyon (şekil 2A) için hazır olun. Rochester Ochsner forseps kullanarak 25 G iğne ucu break ve ucu bir 10 cm uzunluğundaki PE20 poliüretan tüpü yerleştirin ( Malzemeler tabloiçin bakınız) (şekil 2A). Bulldog kelepçeleri kateter manipülasyonu ve ekleme için kullanarak fare, yanal kuyruk ven kateteri yerleştirin ( Malzemeler tabloiçin bakınız) (şekil 2B). Eklenen iğne cyanoacrylate tutkal bir damla ile güvenli. İzin için 20 kuru tutkal bulldog kelepçe kaldırmadan önce s. Dikkatle Na-Fl solüsyon (şekil 2B) içeren bir şırınga bağlı 25 G iğne kateterin diğer ucunu bağlayın. Not: Kuyruk ile bulldog kelepçe kelepçe değil; yalnızca hassas kateter işleme için kullanılır. Uygun kateter ekleme içine saydam tüp kan reflü tarafından onaylanabilir. Hayvan stereomicroscope altında yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). Alt düzey autofluorescence yeşil kanal kullanarak (480 nm), odak nispeten büyük kan damarları (göründükleri bu dalga boyu ışıkta hemoglobin emilimini nedeniyle daha koyu) ve daha küçük kılcal damarlar (şekil 2C) içeren bir bölge. Kısa bir süre önce arka plan floresan bir ölçüm için floresan boya hızlandırılmış edinme başlatın.Not: Alternatif olarak, hızlandırılmış kayıt T0 anlık görüntü resimleri tarafından değiştirilebilir ve herhangi bir diğer zaman Puan önceden belirlenmiş. Yavaş ve sürekli bir hızda çözüm enjekte veya alternatif olarak, bir otomatik infüzyon sistemi kullanın. Kanda tespit Na-Fl Floresans istikrarlı kalmalıdır (half-life kan: 286 dk), birkaç dakika kafatası pencereden BBB Difüzyon kaydı sağlar. Satın alma işlemi tamamlandıktan sonra dikkatle kateter kaldırmak ve hayvan tarafından servikal çıkığı ötenazi. İn vivo BBB geçirgenliği belirlenmesiNot: Değerleri ImageJ gibi herhangi bir görüntü işleme yazılımı Floresans sinyal yoğunluğu ölçümü faiz (ROI) özel bir bölge içinde sağlar elde edilir. Ek açıklama aracını kullanarak bir dikdörtgen şeklinde yatırım Getirisi bir kan damarı dışında beyin dokusunda çizmek, yaklaşık 5 mikron görünür herhangi bir kan damarları mesafeden Na-FL Not ile yatırım Getirisi ve T0 ki ROI içinde ölçülen Floresans yoğunlukta boyutları dolu olan boş doku’için kullanılan s autofluorescence. Postinjection vakit (tüm çözüm hayvana enjekte edildiğinde Örneğin, son kaydedilen çerçeve) üzerine gelin ve Not ROI (şekil 2C) içinde ölçülen kesin zaman ve floresan değerler için yatırım Getirisi yerinden olmadan, Hızlı ileri sarmak. ROI görünür kan damarı (şekil 2C) hareket ve kandan T0 autofluorescence değerini not alın. ROI yerinden olmadan, aynı saat noktasına 3.2.1. adımda tanımlanan ileri sar. ve ROI (şekil 2C) içinde ölçülen Floresans değeri not. BBB geçirgenliği belirlemek için (1.3 bölümünden uyarlanmış) aşağıdaki formülü kullanın: Burada, dFbeyin Floresans yoğunluk değeri eksi T0 boş değeri beyinde, dT Alım süresi noktası saniyede, A olduğunu YG alanı kare santimetre ve olarak alınan yaklaşık gemi yüzey alanı dF kan kan T0 boş değeri eksi floresan yoğunluğu değerdir.Not: BBB için beklenen geçirgenlik değerleri 10-6 cm/s aralığı (Tablo 1) olması gerekir. Fare beynindeki floresan nano tanecikleri tespiti için işleme doku Hasta kaynaklı glioblastoma küreler (5 x 104 hücreleri steril PBS 5 µL) imzalat 6-hafta-yaşlı kadın NMRI çıplak fareler corpus callosum implant. Bu beyin bölgesi Bregma başlayarak aşağıdaki stereotaksik koordinatları bulun: hastanın + 0,5 mm, sol sağa + 2.5 mm, dorsoventral + 3 mm. izin vermek için 2 hafta büyümeye beyin tümörü. Nano tanecikleri intravenöz enjekte (100 µL steril fizyolojik çözüm içinde 100 µg) ve 8 h. enjekte için denetim fareler intravenöz steril fizyolojik çözüm 100 µL ile dolaşmaya izin. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi ve hızla isopentane kuru buz (1dk-50 °C) üzerinde muhafaza içinde ek-dondurma için beyin toplamak. -80 °C de beyin doku işleme kadar saklayın. Koronal beyin bölümleri ile bir cryomicrotome kesin. Kafa içi implantasyon korteks üzerinde kurulan ve 9 µm kalınlığında bölüm ( Tablo reçetesigörmek) uygun mikroskop slayta alandaki durdur yara bulun. Buz gibi PBS slaytları üzerinde immobilize beyin bölümleri bırakın (2 x 5 min için) ve sonra buz gibi %4 oranında tamir PFA (5 dk için). Slaytları PBS içinde yıkayın (3 x 5 dk RT az için). Slaytları yatay konuma getirin ve damlalıklı engelleme çözüm içeren % 10 fetal sığır serum PBS içinde doku (RT, 500 µL/Slayt 1 h için) tüm yüzeyini örten bölümleri. CD31 antikor hazırlamak ( Malzemeler tabloiçin bakınız) çözüm/slayt engelleme 250 µL içinde. Engelleme çözüm antikor ile değiştirin ve gecede kuluçkaya 4 °C oksijen odasında. Ertesi gün, PBS slaytları bırakın (RT, 5 min için 3 x) ve onlara karşılık gelen fluorophore Birleşik ikincil antikor (PBS 250 µL RT, 2 h, 1:500) ile kuluçkaya. PBS (RT), 3 x durulama ve hücre çekirdeği 1 µg/ml dH2O son bir konsantrasyon, DAPI çözüm kullanarak counterstain (250 µL/slayt). Örnekleri RT. Kaldır DAPI çözüm, 7 dk için kuluçkaya ve slaytlar 3 yıkama x dH2O. Her doku bölüm üzerinde bir damla montaj orta Ekle ( Malzemeler tabloiçin bakınız) ve örnekleri bir coverslip ile güvenli. Hava kabarcıkları entrapping kaçının. 4 °C de örnekleri depolamak ve ışıktan confocal mikroskobu gözlemler kadar korumalı tutun.