皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

動物実験は動物実験の南フィンランド地区 (ESAVI/6285/04.10.07/2014) のための委員会によって承認されました。 1. BBTB Mimics の確立 注:細胞培養液やサプリメント素材の表で詳細に説明します。 アストロ サイトの準備注:次のボリュームは 10 cm シャーレまたはコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコに適しています。 無菌細胞文化フードの下で滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 5 mL の培養アストロ サイトを慎重に洗います。優しく真空ポンプを使用して PBS を破棄し、5 分の細胞解離試薬の 2 mL を追加 (37 °C、材料表を参照してください)、細胞をデタッチします。顕微鏡下で細胞の剥離を確認します。培養細胞のストレスを制限する 5 分を超えないようにします。 細胞解離試薬の活性を阻害する容器に 10 mL 滅菌完了アストロ サイト細胞培養培地 (ABM +) を追加します。滅菌血清ピペットを使用すると、滅菌 15 mL チューブに容器から剥離細胞を転送します。250 メーカで 3 分の細胞懸濁液を遠心分離 (加速度: 9 メーカ/秒、減速: 5 メーカ/s) 室温 (RT) で。 一方、挿入 (材料の表を参照) を準備: 滅菌鉗子を使用して、滅菌 6 ウェル プレート (図 1 b) の蓋の脳側 (図 1 a) を挿入を配置。あらかじめプレートは挿入には接触または処理中に挿入を移動しなくても逆さま配置することを確認します。注:挿入の適切な配置によって、膜と井戸の底アストロ サイトのサスペンションのわなに掛ける事の間できます。 細胞懸濁液; から上澄みを慎重に廃棄、遠心分離後アストロ サイトのペレットを再懸濁します優しくチューブ’にペレットを再で ABM + 1 ml s 壁まで 5 倍。細胞にストレスを制限する細胞の過剰なピペッティングを避けてください。セルをカウントし、1.5 倍の ABM の 400 μ L で 10 の5細胞に細胞懸濁液密度を調整 + 挿入します。 挿入’の脳側の真ん中に細胞懸濁液を置く s 膜 (図 1 b) と、非常に慎重に滅菌ピペット先端部にキャピラリー力を使用して、それを広めます。膜は特に壊れやすいので、直接接触を避けます。 まだ挿入の脳側まで、ドライブベイ カバー背面 6 ウェル プレートを置きます。これは井戸 (図 1) の実際の底と膜間細胞懸濁液がトラップされたことを保証します。それはアストロ サイト細胞膜上の均一な拡散を防ぐ細胞懸濁液、空気の泡を避けてください。 インキュベーターに上プレートとインサートで、脳側に置きます (37 °C 5 %co2) (人間プライマリ アストロ サイト) 2 h (マウスアストロ不死化) と最大 6 h 以上の細胞接着を許可します。注:挿入は逆さまに維持される、細胞粘着の視覚化を顕微鏡下でことすることはできません。したがっては、セルごとに通常の培養器をシードし、時間の経過とともに血管内細胞接着を制御する勧めします。膜の操作は、膜が破損している場合結果は信頼性の高いする必要があります注意してください。 インキュベーション時間の最後に、シード圏外細胞懸濁液漏れの有無を確認、水漏れしている場合、挿入を破棄します。6 ウェル プレートが血液側 (図 1 a) を挿入して、正規の位置に戻します。各ウェルに ABM + 2.6 mL を追加します。各挿入に完全なアストロ サイト媒体の 2.5 mL を注ぎ、インキュベーターにプレートを置き (37 °C 5 %co2)。 血管内皮細胞の調製注:マウスの脳微小血管内皮細胞 (bEND3)、セル最大細胞間の接触実験の日に最適なタイト結合蛋白の発現をトリガーできるように 100% 合流点に到達する必要があります。これはアストロ サイトの存在は、これらのセルのタイト結合蛋白発現に必要なひと臍帯静脈血管内皮細胞 (HuAR2T) の適用はされません。 (手順 1.1.1 と 1.1.2) アストロ サイトの前述のように進みます。上澄みを慎重に廃棄後、遠心分離内皮細胞ペレットを再懸濁します’チューブに細胞懸濁液をゆっくりとピペッティングによる (EBM +) 完全な血管内皮細胞を培養するための培地 1 ml s 壁まで 5 倍。細胞にストレスを制限する細胞の過剰なピペッティングを避けてください。セルをカウント、2.5 mL の 2 × 105セルに細胞懸濁液の密度を調整/血清 (EBM-) と血管内皮増殖因子を欠いている内皮細胞培地の挿入-(VEGF A)。 挿入を含むプレートを取り出し、慎重に血液側から媒体を廃棄し、内皮細胞懸濁液 2.5 mL を置き換えます。インキュベーターにプレートを返す (37 °C 5 %co2) 血管内皮細胞膜に付着するため一晩おきます。 次の日は、prewarmed 無血清アストロ サイト媒体 (ABM-) の 3 mL を各ウェルに転送することによって滅菌 6 ウェル プレートを準備します。滅菌ピンセットで挿入を処理することによりには、慎重に血液側から内皮細胞の完全な媒体を廃棄、ABM-を含む新しいプレートに挿入を配置し、EBM の 2.5 mL を追加します。注:EBM の使用は内皮の障壁を確立するための重要な (ディスカッション セクションを参照してください)。 インキュベーターの挿入のまま (37 °C 5 %co2) 最小限の物理的な障害と血管内皮の基底膜の生産を許可する 5 日間の温度変化とアストロ サイトの連絡先血管内皮細胞と、最終的には、BBTB 模倣形成。神経膠腫細胞の培養上の転送の日に媒体を交換 (セクション 1.4 を参照してください)。 (省略可能) BBTB 模倣透磁率測定 挿入の脳側に血液中から時間をかけて小分子蛍光色素フルオレセイン (Na フロリダ州) の受動の拡散は、次の数式によると透磁率の値の計算を使用できます。ここでは、特定セル培蛍光値を引いた時点で井戸で測定された蛍光値をdFもは、 dTは秒単位で時間、平方センチメートルとの障壁の表面は、dFを挿入中の蛍光値を引いた同じ時点で挿入単位蛍光値)。 血と BBTB 模倣の脳側の両方から媒体の 100 μ L を収集し、その後蛍光測定用別平底、黒 96 ウェルのプレートにそれらのそれぞれを転送します。空白として普通のメディアを使用して、自発蛍光を修正します。 Na フロリダ州の井戸あたり 2.5 mL を準備 (50 μ M) における EBM-。37 ° C への Na フロリダ解決策を prewarm します。挿入の血液側からメディアを含む Na フロリダ州開始タイマー培地を交換するとすぐにメディアに置き換えます。 慎重に血と 5、30、60 での挿入の脳側の両方からメディアの 100 μ L を収集し、120 分は黒 96 ウェル プレートの井戸を分離する各サンプルを転送します。 したがって、双方のボリューム バランスを維持するために挿入から収集されたメディアを交換します。温度の変化を最小限に抑えるための各サンプル コレクションのインキュベーターにインサートを配置します。 480/560 の設定フィルター プレート リーダーを使用して、収集されたサンプルからの蛍光性を定量化する nm (励起と放射、それぞれ)。注:脳側から蛍光がほぼ 5 分時点で検出です。ブランクと比較して高い値のリークを示す/挿入’にダメージを与える s 膜または障壁;したがって、これらのさらなる解析から除外します。10-5 10-6 cm/s 範囲 (表 1) で、BBTB の予想される Na フロリダ透磁率の値をはずです。 神経膠腫細胞の調製注:膠芽腫の患者由来の球はここで使われますが、次のプロトコルが付着、市販膠芽腫細胞 U-87 MG など簡単に合わせることができます。 必要に応じて、蛍光イメージングのために最大 4 つのラウンドの滅菌ホウケイ酸 coverslips に配置 (ø 0.9 cm) 2 mL ポリ-D-リジン (0.01%) を含む 6 ウェル プレートのウェルあたり。30 分間室温でインキュベートします。 一方、慎重に腫瘍球細胞培養容器からに転送滅菌血清ピペットを使用して 15 mL 滅菌チューブ。250 メーカで 3 分間腫瘍球を遠心します。 上澄みを廃棄、優しく bFGF 空き EGF (GBM-) 神経膠腫細胞培地 1 mL で球を再懸濁します、セルをカウントします。約 104球/ml (105セル/mL) に糸球体基底膜 – 細胞密度を調整します。 井戸からポリ-D-リジンを破棄し、洗浄し滅菌 PBS の 3 倍。シード 3 ml/腫瘍回転楕円体懸濁液のプレート、腫瘍細胞懸濁液上 BBB 模倣と挿入。 一晩インキュベート (37 °C 5 %co2) アッセイの腫瘍側血液と脳との間の平衡を許可します。次の日に EBM – 興味の分子/薬/粒子を添加した血液側でメディアを置き換えます。サンプルは、前のセクションで説明したように直接定量化のため時間をかけて収集されます。細胞の蛍光イメージングのための正確な時点で修正される (セクション 2.1 と 2.2 を参照してください)。 2. 高分解能共焦点イメージング、BBTB 注: 4% パラホルムアルデヒド (PFA、pH 7.4 BBTB あたり 6 mL) 常に PBS で新鮮な準備です。氷の上におきます。 注意:PFA は、発がん性があります。PFA を処理し、化学の発煙のフードの下で溶液を調製するニトリル手袋を使用します。 BBTB 内皮タイト結合タンパク質発現 氷冷 PBS で膜の両側をリンス (3 x 5 分、2.5 mL の挿入、3 mL/よく)。PBS を破棄し、3 mL と氷の 4% の 2.5 mL を追加 PFA 井戸と挿入、それぞれ。10 分破棄、PFA の氷の上を孵化させなさい (機関’によると s 有害化学処分) と RT (2.5 mL/挿入、3 mL/ウェル) に PBS で 3 x をすすいでください。注:一度固定、サンプルに格納できる PBS (2.5 mL/挿入、3 mL/ウェル) 4 °C で 1 週間。 綿棒を使用して、挿入の脳側を一掃し、アストロ サイトを削除します。鋭いメスを使用して、膜の十字 2 つの垂直カットすることによって慎重に 4 等分に切り。次に、挿入の壁に膜がアタッチされている時点でメスを挿入し、4 つのサンプルを解放するためにもう一方の手で挿入を回転させます。高級ピンセットを使用して、慎重に PBS/まあ、各井戸を血液側に 200 μ L を含む 24 ウェル プレートに各サンプルを転送します。 10% 牛胎児血清の PBS (常温、200 μ L/ウェル分) のための膜をブロックします。タイト結合免疫染色蛋白質 (図 1) の 1°抗体溶液を準備 (精巣毛細血管-1、クローディン-5;材料の表を参照してください) ソリューション/ウェルをブロックの 200 μ L で。必要に応じて、内皮細胞の識別、各タイト結合抗体溶液に血小板内皮細胞接着分子 (PECAM1 または CD31;材料の表を参照してください)、抗体を追加することによって検証されます。ブロッキング液を捨て、一次抗体’ O/N 4 °c. で孵化させなさい 次の日に一次抗体を破棄し、200 μ L の PBS で洗浄し (常温 5 分の 3 倍)。適切な種特異的蛍光標識二次抗体とそれらを孵化させなさい (1: 500 希釈 200 μ L/ウェルがブロッキング液で希釈した;材料の表を参照してください 2 時間室温 二次抗体を破棄、200 μ L の PBS で洗い (常温 5 分の 3 倍)。PBS を取り外して、4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 溶液 1 μg/mL の純粋な蒸留水 H2O (dH2O; 200 μ L/ウェル;材料の表を参照してください最終的な集中を使用して細胞核を counterstain).DAPI ルート削除で 7 分間インキュベートし、洗って膜 3 dH2O と x (200 μ L/ウェル)。 メディアをマウント一滴を配置 (材料表参照) ガラス顕微鏡スライドの上。高級ピンセットを使用して、慎重に膜を取り出すだけでなくと向きを維持し、dH2O の過剰を削除メディアをマウントの上に置きます。膜上にメディアをマウントの別のドロップを追加し、慎重にカバー ガラスとそれをカバーします。内包された空気の泡がないことを確認します。共焦点顕微鏡観察まで 4 °C におよび光源から離れた側のサンプルを格納します。注:アストロ サイト染色 24 ウェル プレート、脳側と選択したアストロ サイト特異的抗体の使用の膜の部分を配置することによって実行できます (例えば、グリア線維性酸性蛋白質 [GFAP] に対して監督) (図 1E). BBTB 蛍光ナノ粒子トランスサイトーシスを検出する染色 生細胞リソソームのラベリングを行う (例えば、蛍光プローブの使用 [材料表を参照])。50 の作業濃度でリソソーム蛍光染料を薄める nM prewarmed EBM – (2.5 mL/挿入) または ABM prewarmed-75 mm (3 mL/ウェル) リソソームのそれぞれの血管内皮細胞とアストロ サイト、ラベリングします。45 分のセルを孵化させなさい (37 °C 5 %co2);その後、氷冷 PBS (2.5 mL/挿入、3 mL/ウェル) と 3 x をすすいでください。 PBS を破棄し、3 mL と氷の 4% の 2.5 mL を追加 PFA 井戸と挿入、それぞれ。氷上で 10 分間破棄 PFA を孵化させなさいし、リンスの細胞 3 x ((RT)、2.5 mL/挿入、3 mL/ウェル) PBS の。注:一度固定、サンプルに格納できる PBS (2.5 mL/挿入、3 mL/ウェル) 4 ° C で 1 週間。 PBS を削除し、dH2O に 1 μ g/mL (1 mL/挿入、1 mL/ウェル) の最終濃度の DAPI 溶液を使用して細胞核を counterstain します。ルート削除で 7 分間、DAPI を孵化させなさい、洗って膜 3 dH2O (2.5 mL/挿入、3 mL/ウェル) と x。 慎重に膜を切り取り、dH2O の過剰を削除およびメディアをマウントの上に置きます (材料表参照) ガラス顕微鏡スライドの上。膜の反対側に取り付け中の別のドロップを追加し、慎重にカバー ガラスとそれをカバーします。内包された空気の泡を避けるため。4 °C でサンプルを格納し、それらを共焦点顕微鏡観察までの光から保護維持します。 腫瘍細胞の蛍光染色 高級ピンセットを使用して、慎重に氷冷 PBS でいっぱい 24 ウェル プレートに腫瘍の球を含むラウンド coverslips を転送します。生細胞リソソーム 75 蛍光リソソーム プローブを使用したラベリングを続行 prewarmed GBM の nM (200 μ L/ウェル)。45 分; サンプルをインキュベートします。洗浄し、氷冷 PBS の 3 倍 (200 μ L/ウェル)。 PBS を破棄し、200 μ L/ウェル冷たい PFA を追加します。10 分破棄、PFA の氷の上を孵化し、リンス サンプル 3 (常温) PBS の x。注:サンプルを PBS で格納できる固定、一度 (200 μ L) 週 4 ° C で。 PBS を削除し、dH2O で 1 μ G/ml の最終的な集中に DAPI 溶液を使用して細胞核を counterstain (200 μ L/ウェル)。ルート削除で 7 分間、DAPI を孵化させなさい、洗って coverslips 3 dH2O と x (200 μ L/ウェル)。 高級ピンセットを使用して、coverslip を取る、dH2O の過剰を削除、メディアをマウントの上に置きます (材料の表を参照してください) ガラス顕微鏡スライドの上。空気の泡を封入しないでください。4 °C でサンプルを格納し、それらを共焦点顕微鏡観察までの光から保護維持します。 3. 生体内のの比較研究 BBB を通じてナトリウム フルオレセイン拡散の原記録 生理学的なソリューションの 50 nM Na フロリダ ソリューションの 150 μ L を準備します。37 °C 点滴配信時にソリューションをしてください。 ケタミン ・ キシラジン カクテル (PBS で、100 mg/kg 10 mg/kg とケタミン キシラジンの 300 μ L) の腹腔内注入マウスを麻酔します。深い麻酔が確立されると、その体温を維持するために加熱パッドに動物を配置します。注:10 週齢雌の海軍医学研究所 (技研) 裸免疫不全マウスは、図 2で示したデータを取得に使用されています。しかし、このプロトコルは免疫と免疫不全マウスに適応です。麻酔・鎮痛法は、’科学裁量。ただし、BBB 透過性18が大幅に増えると、イソフルランなどの吸入麻酔はお勧めしません。 脳定位固定装置のフレーム上にマウスを置く (材料の表を参照してください) 高級ハサミ頭蓋骨を明らかにする高級ピンセットを使用して、結合組織の穏やかな dilacerations 続いて頭皮の縦切開を行い。微細ドリルで円形の動きを使用して、左または右頭頂骨から頭蓋骨の ø の 0.3 mm の円形の部分を削除します。掘削中に、基になる硬膜組織や血管の傷害を回避する頭蓋骨部分を除去しながら慎重に進みます。 公開される組織の生理的溶液の一滴を配置します。微細鉗子の 2 つのペアを使用して、大脳皮質にアクセスする硬膜組織を慎重に取り外します。脳組織は、空気と直接接触してはいけません。注:硬膜の損傷からマイナーな出血を停止するには、血液のスポンジ (材料の表を参照してください)。 一度硬膜組織が削除され、大脳皮質は完全にさらされる、皮質と ø 0.5 mm ホウケイ酸 coverslip の生理的溶液のドロップをわなに掛けます。シアノアクリ レート系接着剤のドロップで観察領域を確保 (材料の表を参照してください)、針、coverslip の周りに 。聞かせて 1 分乾燥接着剤。 埋込型カテーテルを尾静脈注射 (図 2 a) に備えます。ロチェスター オクスナー鉗子を使用して 25 G 針の先端を打破し、10 cm ロング PE20 ポリウレタン チューブの先端を挿入 (材料の表を参照してください) (図 2 a)。 カテーテル操作と挿入のためブルドッグ クランプを使って、マウスの外側尾静脈にカテーテルを挿入 (材料の表を参照してください) (図 2 b)。シアノアクリ レート系接着剤のドロップで挿入した針を固定します。みましょう 20 乾燥接着剤ブルドッグ クランプを取り外す前に s。慎重に Na フロリダ ソリューション (図 2 b) が含まれている注射器に接続されている 25 G 針にカテーテルのもう一方の端を接続します。 注:ブルドッグ クランプ; と尾を固定しないでカテーテルの正確な処理のための使用だけです。適切なカテーテル挿入は、透明なチューブに血液逆流現象によって確認できます。 個人差の下で動物を配置 (材料の表を参照してください)。緑のチャネルで低レベルの自発蛍光を使用して (480 nm)、比較的大きい血管 (彼らはこの波長で光のヘモグロビンの吸収のため暗く見える) と小さい毛細血管 (図 2) を含む領域に焦点を当てます。背景の蛍光性の測定値を得るに蛍光色素を注入する前に簡潔にコマ撮りの集録を開始します。注:または、コマ撮り録画 T0 からスナップショットの画像で置き換えることができ、他から所定の時間ポイント。 ゆっくりと継続的なペースで溶液を注入または自動注入システムを使用する代わりに、します。Na フロリダ州蛍光の血液中に検出する必要があります安定 (血中半減期: 286 分)、数分頭蓋窓から BBB 拡散の記録が可能します。買収が完了する、慎重にカテーテルを削除、頚部転位によって、動物を安楽死させます。 BBB 透過性の体内注:利益 (率 ROI) のカスタム領域内の蛍光信号強度の測定を許可する ImageJ などの画像処理ソフトウェアから値を取得します。 脳組織で、血管の外に投資収益率を四角形を描画注釈ツールを使用して、約 5 μ m で、目に見える血管からの距離は Na フロリダ州メモでいっぱい投資収益率とその ROI の T0 で測定された蛍光強度の寸法を’組織の空白として使用される s 蛍光。投資収益率をずらすことがなく早送り注射後時間を指す (例えば、ソリューション全体が動物に注入されたときの最後の非常に記録されたフレーム) と投資収益率 (図 2) で測定した正確な時間と蛍光の値に注意してください。 目に見える血管 (図 2) に投資収益率を移動し、血液から T0 蛍光値に注意してください。投資収益率をずらすことがなく 3.2.1 のステップで定義されている同じ時間ポイントに早送りします。蛍光値を測定 ROI (図 2) に注意してください。 BBB 透過性を決定する (セクション 1.3 から適応) 次の数式を使用します。 ここでdF脳は脳内 T0 空白値を引いた蛍光強度値、 dTは秒で集録時間ポイント、A は平方センチメートルとの ROI 領域としておおよそ容器表面積 dF血血で T0 空白値を引いた蛍光強度の値です。注: BBB の予想される透過性値 10-6 cm/s の範囲 (表 1) にする必要があります。 マウス脳における蛍光ナノ粒子の検出のために処理するティッシュ 麻酔 6 週齢女性当所ヌードマウスにおける脳梁の膠芽腫の患者由来の球 (5 × 104 5 μ L の滅菌 PBS セル) をインプラントします。前から始まって次の定位座標でこの脳領域検出: 前後 + 0.5 mm、左右に 2.5 mm、イエコウモリ + 3 mm. こと 2 週間成長する脳腫瘍。 ナノ粒子を静脈内注入 (滅菌生理溶液を 100 μ l 添加の 100 μ g) 8 h. 注入コントロール マウス静脈内の滅菌生理溶液 100 μ L を循環するようにし、。 頚部転位によってマウスを安楽死させるし、ドライアイス (-50 °C 1 分) で保持されるイソペンタンでスナップ凍結用急速に脳を収集します。ティッシュの処理まで-80 °C で脳を格納します。 Cryomicrotome とコロナの脳のセクションをカットします。傷跡それは皮質に形成され、(材料表参照) 適切な顕微鏡スライド上にその地域から 9 μ m 厚のセクションをカットして頭蓋内注入を見つけます。 氷冷 PBS のスライドに固定されている脳のセクションを浸す (5 分の 2 倍) と、冷えた 4% でそれらを修正し、PFA (5 分) のため。PBS でスライドを洗う (常温 5 分の 3 倍)。水平方向にスライドを配置し、ピペット、ブロッキング ソリューション含む 10% 牛胎児血清 PBS で組織のセクション (常温、500 μ L/スライド 1 h) の全体の表面を覆います。CD31 抗体を準備 (材料の表を参照してください) ソリューション/スライド ブロックの 250 μ L で。抗体とブロッキング液を交換し、4 °C 加湿チャンバー内で一晩インキュベートします。 次の日、PBS でスライドを浸す (常温 5 分 3 x)、対応する蛍光標識二次抗体 (RT で 2 h の 250 μ L の PBS で 1: 500) とそれらを孵化させなさいと。(常温) PBS で 3 x を洗浄し、dH2O で 1 μ G/ml の最終的な集中に DAPI 溶液を使用して細胞核を counterstain (250 μ L/スライド)。削除した DAPI ソリューションで 7 分間サンプルをインキュベートし、スライド 3 を洗って dH2o ・ x 各組織切片の封入剤 1 滴を追加 (材料の表を参照してください)、観察試料を固定します。空気の泡を封入しないでください。4 °C でサンプルを格納し、それらを共焦点顕微鏡観察までの光から保護維持します。