التنبؤ في فيفو حمولات التسليم استخدام ورم-حاجز دم في الدماغ في صحن
Summary
المخدرات تستهدف لاورام الجهاز العصبي المركزي يشكل تحديا رئيسيا. هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتنتج تقليد في المختبر الدم في الدماغ الورم-الحاجز باستخدام خلايا موريني و/أو البشرية ومناقشة أهميتها بالنسبة للقدرة على التنبؤ بورم في استهداف المجراة في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
انتقائية للغاية في طبيعتها، حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) أمر ضروري للتوازن الدماغ في الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، في سياق الإصابة بأورام الدماغ، انتقائية BBB الجزيئية أيضا الدروع الخلايا الورمية بحظر تسليم تشيموثيرابيس تدار التبرعات محيطيا. تطوير أدوية جديدة (بما في ذلك جسيمات نانوية) استهداف أورام الدماغ الخبيثة مثالي يتطلب استخدام نماذج حيوانية الإكلينيكية لدراسة ترانسسيتوسيس على المخدرات وفعالية انتيتومور. بغية الامتثال لمبدأ 3R (صقل والحد واستبدالها) الحد من عدد الحيوانات المختبرية في الإعداد التجريبي وإجراء الفرز الفائق لمكتبة كبيرة من وكلاء انتيتومور، قمنا بتطوير إنسان في المختبر استنساخه و مورين من تقليد الدم في الدماغ الورم-الجدار (بتب) استخدام الثقافات ذات الطبقات الثلاث خلايا بطانية، أستروسيتيس، ومجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض. لأعلى من قابلية وإمكانية تكرار نتائج، استخدمت خطوط تجارية الخلية أو الخلايا مخلدة في ظروف مصممة خصيصا للسماح بتشكيل حاجز تشبه BBB الفعلية. هنا يصف لنا وضع بروتوكول للحصول على تقليد بتب باستزراع خلايا بطانية على اتصال astrocytes كثافة الخلية المحددة على إدراج. يمكن استخدام هذا تقليد بتب، على سبيل المثال، للقياس الكمي وتصوير [كنفوكل] المرور نانوحبيبات عبر الحواجز بطانية وأستروسيتيك، بالإضافة إلى التقييم لاستهداف خلية الورم داخل الإنزيم نفسه. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أنه يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها للتنبؤ بسلوك الجسيمات النانوية في نماذج حيوانية الإكلينيكية. من منظور أوسع نطاقا، هذا النموذج في المختبر يمكن تكييفها لسائر أمراض الأعصاب لتحديد مرور جزيئات علاجية جديدة من خلال BBB و/أو استكمالها مع أورجانويدس الدماغ تقييم الفعالية مباشرة المخدرات.
Introduction
وتتكون وحدة neurovascular الخلايا العصبية، أستروسيتيس وبي بي بي، شكلتها اتصالات معقدة بين بيريسيتيس، أستروسيتيس، وخلايا بطانية والغشاء الطابق السفلي يرتبط تشكيل ميكروفاسكولاتوري الدماغ1. وينظم هذا الجدار الخلوي ضيق يتكون من سفن المستمر، نونفينيستراتيد ناعما حركة الأيونات والجزيئات (بما في ذلك الهرمونات أو المواد الغذائية أو الأدوية) ولكن أيضا تعميم خلايا1. ترانسسيتوسيس المنخفضة لا سيما من خلال BBB الجزيئات عالية الوزن الجزيئي، مثل الأجسام المضادة العلاجية، ويصرف المخدرات، أو نانوكومبوندس، كبير يقيد التقدم في اكتشاف الأدوية للأمراض العصبية، بما في ذلك الخبيث gliomas2. وفي الواقع، تشيموثيرابيس المسلمة شفويا أو عن طريق الوريد تصل إلى حمة الدماغ غالباً في تركيزات منخفضة على نحو كاف للحث على تأثير انتيتومور أو هي ببساطة غير قادر على عبور بتب للوصول إلى الخلايا الورمية3. العديد من الدراسات السريرية والاكلينيكية لم تعالج مسألة الاختراق بتب لكن حاولوا عرقلة بتب عابر، على سبيل المثال باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة4،5، أو التحايل عليه بالمباشرة في الموقع تسليم المخدرات6. ولكن أيا من هذه التقنيات كانت قادرة على التصدي لتوسع الورم لا مفر منه أو الانتكاس. لذلك، عند تطوير العلاجات أنتيجليوما الرواية، ينبغي النظر نشرها من خلال بتب كأحد الجوانب الحاسمة للنجاح في إيصال العوامل العلاجية7.
نظراً لطبيعة التفاعلات الخلية داخل بتب معقدة للغاية، والدراسات المجراة في الحيوانات المختبرية يبدو أن الاختيار الواضح عند دراسة مرور جزيئات من الدم للدماغ. بيد عالية النطاق المجراة في أساليب معقدة نسبيا لإنشاء، وعليه، لا تسمح للفرز الفائق للجزيئات في فترة زمنية معقولة بتكلفة معقولة. بل الأهم من ذلك، الحيوان اختبار قد اتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية 3R يعرف ط) صقل، ثانيا) الحد، وذات الصلة بالسياق الحالي، ثالثا) استبدال عن طريق بروتوكولات بديلة (على سبيل المثال، في طرق المختبر في السيليكون). ولذلك، إعادة بتب في المختبر يظهر كإمكانية مثيرة للاهتمام وجذابة، ولكن كما أنه يشكل مهمة معقدة تحدي القيود المختلفة. العديد من المحاولات لإعادة هذه المقصورة معقد مع الخلايا الأولية مثقف أو خطوط الخلايا من الكلاب البوليسية، الخنزير، وقد نشرت مورين، وحتى البشرية المنشأ (كما استعرضها الرحمن et al.8 و9من قانون هيلمز et al.). وتشمل هذه النماذج ثلاثية الأبعاد موائع جزيئية نظم10، بي بي بي على رقاقة11،12، والجموع من المتغيرات استناداً إلى ثقافات المشارك الكلاسيكية في إدراج النظم. ومع ذلك، نظم موائع جزيئية والرقائق الحالية أما غير مناسبة للمخدرات السريعة، الفائق–التحقق من صحة الدراسات13،14 أو هي حاليا غير متوافق مع دراسات لإيصال الأدوية إلى أورام الدماغ. وباﻹضافة إلى ذلك، استعراض نماذج منشورة 155 استخدام الخلايا الأولية أو الخلايا الجذعية pluripotent إيندوسيبلي (اللجنة التوجيهية) أو خطوط الخلايا التجارية إدراج مثقف شارك في جميع أظهرت اتجاها للتناقض إينتيرستودي في تلك القياسات و/أو استنتاجات8. يمكن أن يرتبط هذا النقص في إمكانية تكرار نتائج اينترلبورتوري مع شروط الثقافة ط) نونورماليزيد، على سبيل المثال مع الطلاء الاختياري مع الغشاء مصفوفة البروتينات في خلية ثقافة السفينة، ثانيا) عدد متزايد من ثقافة فرعية والاستخدام التي تحتوي على مصل وسائط الإعلام، وكلا المحركات الرئيسية للتعديلات الوراثية والمظهرية ل خطوط الخلية15، أو الثالث) صعوبة لتكاثر إعادة التوازن الصحيح بين أستروجليال ومكونات غشائي في طبق. على الرغم من أن استخدام تجاري خلية أو خلايا مخلدة الخطوط لإنشاء نموذج BBB في المختبر تفتقر إلى بعض خصائص مقارنة بنماذج مماثلة فقط استخدام الخلايا الأولية، في وصف الأسلوب نظهر أن الحق في الجمع بين خلايا معارض جداً الأداء مقارنة بنشر دراسات في نماذج أخرى من مرجع16،17. في نهاية المطاف، عدم وجود نموذج قوي واستنساخه لدراسة مرور المركبات العلاجية استهداف أورام الدماغ عن طريق بتب دفعتنا إلى تطوير الأساليب الموصوفة هنا.
نظراً لأن الهدف لاستخدام النموذج التنبؤ المجراة في إيصال جسيمات نانوية في نماذج حيوانية الإكلينيكية، نحن أولاً التحقق من صحة النموذج بتب باستخدام إدراج تحتوي على خلايا بطانية مورين على اتصال astrocytes مورين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا الأمثل نموذج لاستخدام بعض خطوط الخلايا البشرية. تستقر، يتم تحويل الحواجز الخلية للثقافات مع مجالات جليوبلاستوما المستمدة من المريض أو خطوط الخلايا الدبقي التجارية. وبعد ذلك، يمكن تصور بالفحص المجهري [كنفوكل] ترانسسيتوسيس جسيمات نانوية واستهداف خلية الورم وكمياً بجمع العينات على مر الزمن. الأهم من ذلك، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام يقلد بتب يمكن موثوق بها التنبؤ بسلوك جسيمات نانوية المجراة، دعم استخدام مسبقة تقليد بتب التحقق من الصحة السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ظهور مفهوم تقلب الورم إينتيرباتينت شبابها البحوث المتعلقة بالسرطان شخصية الطب21. هذا التغير أيضا من السمات مميزة للأورام الخبيثة في الجهاز العصبي المركزي. نظراً لعدم إمكانية التنبؤ بالورم، استجابة للعلاج الكيميائي إضافة إلى إيواء أثر بي بي بي لإيصال الأدوية، وتماماً ويشكل تحديات كبيرة في رعاية المرضى22. من أجل تطوير علاجات أكثر فعالية، من الضروري غالباً إلى مكتبات شاشة كبيرة من جزيئات جديدة. لتقييم فعالية انتيتومور وقدرة يؤدي العلاجية الجديدة الوصول إلى موقع الورم، هو أفضل خيار الدراسة السريرية على الخلايا المستمدة من المريض مزروع في فيفو إلى الآلهة المريض موريني. أسباب أخلاقية (مبدأ 3Rs عند استخدام الحيوانات المختبرية) والعملية (المالية والوقت، والإنسان، ومرفق الموارد)، هو تطوير منصة الفحص في المجراة على نطاق واسع غالباً ما تكون غير ممكن، ومن ثم فحوصات يستند إلى الخلية وتظل نموذجا لاختيار23. والسبب الرئيسي لاختيار إنشاء خطوط الخلايا وتجنب الخلايا الأولية تيسير إمكانية تكرار نتائج والحد من استخدام الحيوانات المختبرية، التي هي المصدر الرئيسي لعزله وإقامة ثقافات مورين الأولية. طرق عرض هنا، اعتقادا راسخا أن تمتثل 3Rs، يمكن تجاهل كفاءة جسيمات نانوية من تحقيق السريري كذلك على المعيار لعجزها عن عبور نموذج بتب. كإثبات لمبدأ، نحن تصف هنا النتائج التي تم الحصول عليها أثناء التطوير والتحقق من بتب. كنا قادرين على تأكيد النتائج المختبرية المجراة، على سبيل المثال عند قياس نشر السلبي من 376 دا فلوريسسين الصوديوم.
البروتوكول الواردة في هذه الورقة وصف إعداد خلايا بطانية كوكولتوريد مع أستروسيتيس لتشكل واجهة ورم تشبه حاجز دم في الدماغ في إعداد في المختبر. حالما يتم إنشاء احتكاك بين هذه الأنواع اثنين من الخلية، يسلك طبقة الخلايا البطانية أوجه التشابه مع بي بي بي (مثلاً خلية سطحية تعبير البروتينات مفرق ضيق وذات نفاذية منخفضة نسبيا). من المثير للاهتمام، يبدو أن تقليد بتب مورين لتوفير قيم النفاذية نا-فلوريدا خاصة مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام الماوس المجراة في BBB نفاذية القياسات24. ولذلك، سيتم ربط أداء يقلد بتب مباشرة باختيار الخلايا المستخدمة لتشكيل الحاجز. خلايا بطانية bEND3 تنشأ من الدماغ ومن المعروف أن النجاح في إقامة حواجز عند كوكولتوريد مع أستروسيتيس25. ومع ذلك، كنا نستخدم astrocytes هيفكو مخلدة26 لتوليد تقليد بتب. نظراً لعدم وجود عامل نقص إيندوسيبلي، لا تنتج هذه astrocytes VEGF-أ، وهو الجوهر في تحقيق الاستقرار لتقليد بتب الموصوفة هنا. وقد حددت astrocytes المغيرون نفاذية BBB، على سبيل المثال عن طريق الإفراج عن فيجف-أ ردا على نيوروينفلاميشن27. تنشيط مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية (فيجفرس) منظم رئيسي من نفاذية بطانية/الأوعية الدموية في المختبر28 و المجراة في29. ولذلك، تنشيط ملاحق VEGF-ألف في المتوسط VEGFR2 في خلايا بطانية، الذي يدفع الفسفرة أدهيرينس مفرق البروتينات مثل هاء-كادهيرين30. فقدان غشائي خلية-خلية الاتصالات يولد درجة عالية من نفاذية الأوعية الدموية. وبالمثل، كل من الخاصية ميتوجينيك قوية والتكوين غير معروف للأمصال البقري الجنينية المستخدمة في فحوصات الثقافة الخلية يسبب القضايا الرئيسية في الحاجز الاستقرار وفحص إمكانية تكرار نتائج.
الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس) تستخدم أحياناً لتشكيل BBB في المختبر31؛ ومع ذلك، تختلف كثيرا من خلايا الدماغ بطانية microvascular، مثل خط الخلية D3 هكميك/32، من حيث التعبير الجيني وتشكيل حاجز خصائص. بيد نفاذية أعلى نسبيا مقارنة القيم التي تم الحصول عليها مع الخلايا HuAR2T نمت وحدها bEND3 كانت تقلص إلى حد كبير من كوكولتورينج لهم مع البشرية astrocytes الأولية. على الرغم من أن خلايا بطانية مطلوبة لتشكل الجدار الخلوي، فمن الواضح أن أستروسيتيس دور لا يقل أهمية لتشكيل بتب وتحقيق الاستقرار.
عندما تم إضافة مجالات الدبقي المستمدة من المريض إلى هذه المعادلة، تقليد بتب الماوس لخص بعض الميزات لتكثيفها مورين، مثل انتشار المخدرات عن طريق المفرج الدماغ واستهداف الخلايا السرطانية. على سبيل المثال، أن يقلد بتب مناقشتها هنا كانت ناجحة في النسخ المتطابق المجراة في السلوك عندما نحن فحص عدة جسيمات نانوية بأقطار مختلفة. لتوضيح ذلك التوازي بين النماذج في المختبر وفي الحية، استخدمنا جسيمات نانوية سيليكات ميسوبوروس هو موضح سابقا33 مع خصائص اختراق الخلية34 مترافق لاستهداف الورم الببتيد قن على بهم surface20. منازل الببتيد استهداف حظيرة لخلايا الورم الغازية عن طريق الربط المحددة لمثبطات النمو المشتقة من الثديية (مدجي). هي عدة أنواع السرطان، بما في ذلك جليوماس، أوفيريكسبريسينج مدجي مقارنة بأنسجة طبيعية35، مما يجعل من مجموعة فعالة جداً استهداف الورم حظيرة قادرة على زيادة إيصال حمولة20. جسيمات نانوية المستخدمة هنا قد ثبت سابقا أن منتشر في المخ حمة (27547955)، وعندما فونكتيوناليزيد مع تاكسول، هذه النانو-الشحنات قد نجحت في الحد من النمو الدبقي في نماذج الإكلينيكية36. إضافة مخلفات البولي إثيلين غليكول (شماعة) على السطح جسيمات نانوية حافظت أيضا على التهمة ثابتة للقيم الإيجابية (حول + 4 mV)، مما يتيح التفاعل الأفضل مع وحدة نيوروفاسكولار37 وأيضا زيادة استقرارها في الدورة الدموية. في البيانات المقدمة، وكان مترافق كاتشين 3 من شماعة ل NP110s، بينما كانت مغطاة NP350s كاتشين 10 من الوتد. ومع ذلك، شماعة زيادة الوزن الجزيئي أيضا أدت إلى زيادة كبيرة في قطر نانوحبيبات، ومن ثم قدراتها المادية لعبور BBB. ولذلك، علينا التحقق ما إذا كان الأبعاد الفيزيائية للجسيمات حالت دون مرورها عبر بتب وعما إذا كانت هذه الملاحظات يمكن أن تكون متطابقة المجراة.
ووفقا للملاحظات التي تم نشرها في السابق، لاحظنا أن NP110s اكسترافاساتيد عن طريق بتب في المختبر وبي بي بي من الفئران تحمل الأورام داخل الجمجمة، بينما NP350s الإبقاء على الجانب لومينال تقليد بتب وفي الأوعية الدموية من الفئران. هذه النتائج مماثلة توحي بقوة أن تنبأ النموذج بتب المجراة في قدرة جسيمات نانوية عبور BBB وتصل إلى الدماغ.
وكثيراً ما تناقش أهمية النماذج الخلوية من بي بي بي، حتى لإيصال المركزية من جسيمات نانوية38. نعرض هنا أن أستروسيتيس الأولية وخلايا بطانية، كلاهما تعتبر أهم الأدوات في المختبر، يمكن الاستعاضة عن الخلايا مخلدة و/أو المتاحة تجارياً، ضمان قابلية أكبر وإمكانية تكرار نتائج. ويمكن تطوير الجيل القادم من يقلد BBB في المختبر بدمج أجهزة موائع جزيئية، السماح للوحدات المشكلة جميل neurovascular تشبه هيكلياً BBB الفعلية12،14. بيد أن هذه النماذج حاليا غير صالحة للفرز الفائق من الجزيئات التي سلمت إلى جليوماس، بسبب القيود التقنية في المتابعة تسليم14. من الصعب حقاً التقاط الفسيولوجية تعقيد BBB في طبق، ويمكن أن تهدد إمكانية عدم وجود بعض مستقبلات/البروتينات، والمعروف أن تبديها BBB، تفسير النتائج. حجة أخرى تتعلق تقلبات كبيرة في التعبير الجيني بين ظروف المجراة في وفي المختبر، وكذلك من خط خلية واحدة إلى آخر، خاصة بالنظر إلى خلايا بطانية. ومع ذلك، يمكن القول أن وحدة neurovascular ليست كيانا موحدا داخل المخ39. توصلت البحوث العلمية في مجال البيولوجيا حقبة إنسانية حيث نظرت الرفق بالحيوان، والمسؤولية الأخلاقية، وتكلفة استخدام حياة الحيوان دائماً قبل تصميم تجربة. ولذلك، لدعم استبدال الحيوانات، عدد متزايد من الدراسات التي أجريت مؤخرا تظهر أن الوعي بالقيود المفروضة على النماذج والاختيار الدقيق للنماذج الخلوية إنشاء الجدار العازل – مع تشديد على أستروسيتيس – تبرر المباراة بين النتائج التي تم الحصول عليها في صحن وفي الحيوان النماذج40. مع المنهجية الموضحة هنا، نحصل على خطوة واحدة أقرب إلى خفض عدد الحيوانات التجريبية المستخدمة لفحص أغراض ترانسسيتوسيس بي بي بي للمداواة المحتملة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذه البحوث من المنح المقدمة من المنظمات السرطان الفنلندية، وجين & مؤسسة أركو آتوس، وسيغريد جوسيليوس مؤسسة (بفضل V.L.J.)، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (منح المتقدم Postdoc.Mobility لا: P300PB_164732، إلى س. ك.) ومؤسسة أبحاث أوريون (إلى س. ك.)، ومؤسسة النصب التذكاري كويستيلا مود (إلى س. ك.)، وأكاديمية فنلندا (ترفة 2017، منح لا: 314 498). وحدة التصوير بيوميديكوم (هلسنكي) المسلم لتوفير الفحص المجهري التصوير المرافق الأساسية.
Materials
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100x17mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and – medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25-gauge needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL – Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss | ||
References
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors. Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).
- Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
- Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).
- Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, e. l. -. S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
- Levin, V. A. Personalized medicine in neuro-oncology. CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).
- Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
- O’Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
- Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
- Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
- Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
- Claesson-Welsh, L. Vascular permeability–the essentials. Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).
- Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings – IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).
- Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
- Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
- Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
- Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).
- Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).
- Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).
- Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).
