小さなインドのマングースにおけるイオフェノキ酸類似体の分析 (ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)経口狂犬病ワクチン接種生物学的マーカーとしての使用のためのセラ
Summary
バイオマーカーとしてエチルまたはメチルイオフェノシン酸を用いた捕虜マングースプラセボ経口狂犬病ワクチンを提供し、タンデム質量分析法(LC-MS/MS)法を用いた新規液体クロマトグラフィーを用いた餌取り込みを検証した。
Abstract
小さなインドのマングース(ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)は、プエルトリコの狂犬病ウイルス(RABV)の貯水池であり、毎年報告される動物狂犬病症例の70%以上を占めています。野生動物貯水池におけるRABV循環の制御は、通常、口腔狂犬病ワクチン接種(ORV)の戦略によって達成される。現在、プエルトリコには野生動物ORVプログラムは存在しません。口腔狂犬病ワクチンやマングースの各種餌型の研究が有望な結果で行われました。ORVの成功のモニタリングは、標的種による餌摂取の推定に依存しており、これは通常、RABV中和抗体(RVNA)後のワクチン接種後の変化を評価することを含む。この戦略は、アクティブな野生生物ORVプログラムを有する地域、またはRABVが活性化し、RVNAのバックグラウンドレベルが貯水池種に存在する地域では解釈が困難な場合があります。このような状況では、ワクチンまたは餌マトリックスに組み込まれたバイオマーカーが有用であり得る。エチル-イオフェノク酸(et-IPA)を含む16個の捕虜マングースプラセボORV餌を、餌の中に0.4%と1%、外餌マトリックスで0.14%の濃度で提供しました。また、メチル-イオフェノク酸(me-IPA)を含む12個の捕虜マングースORV餌を、外部餌マトリックスに0.035%、0.07%、0.14%の濃度で提供しました。餌の提供の前に血清サンプルを収集し、その後、最大8週間のポストオファリングのために毎週。セラからイオフェノキ酸をアセトニトリルに抽出し、液体クロマトグラフィー/質量分析法を用いて定量した。液体クロマトグラフィー質量分析により、et-IPAまたはme-IPAのセラを分析した。et-IPAとme-IPAに対して、少なくとも8週間と4週間は適切なマーキング能力を見出した。いずれのIPA誘導体も、マングースにおけるORV餌取り込みのフィールド評価に適している可能性がある。マングースセラのマーカーの寿命が長いため、連続した評価中に同じIPA誘導体を使用して結果を混乱させないように注意する必要があります。
Introduction
狂犬病ウイルス(RABV)は、負の感覚一本鎖リサウイルスであり、カルニヴォラとチロプテラの順序内の多様な野生生物貯水池種の間で循環する。マングースの複数の種はRABVの貯水池であり、小さなインドのマングース(ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)は、西半球のプエルトリコと他のカリブ海の島々で唯一の貯水池です 1,2,3.野生動物貯水池におけるRABV循環の制御は、通常、口腔狂犬病ワクチン接種(ORV)の戦略を通じて達成される。米国(米国)では、この管理活動はUSDA/APHIS/野生生物サービス国家狂犬病管理プログラム(NRMP)4によって調整されています。現在、プエルトリコには野生動物ORVプログラムは存在しません。狂犬病ワクチンとマングースの様々な餌の種類に関する研究は、マングースのためのORVプログラムが可能であることを示唆する有望な結果で行われてきました 5,6,7,8.
ORVの影響を監視することは、標的種による餌摂取の推定に依存し、これは通常、RV抗体血清の変化を評価することを含む。しかし、この戦略は、活性野生生物ORVプログラムを有する地域、またはRVが活性化し、RABV中和抗体(RVNA)のバックグラウンドレベルが貯蔵所種に存在する地域において困難である可能性がある。このような状況では、餌または外部餌マトリックスに含まれるバイオマーカーが有用であり得る。
様々な生物学的マーカーは、アライグマ(プロシオンローター)9、10、ストット(ムステラエルミン)11、12、ヨーロッパのバッジ()を含む多数の種の餌の取り込みを監視するために使用されています。メレスメレス)13、イノシシ(Ssscroofa)14,小さなインドのマングース15と草原の犬 (シノミスルドビシアヌス)16,17, とりわけ.米国では、オペレーショナルORV餌は、餌の取り込み18、19を監視するために餌マトリックスに1%テトラサイクリンバイオマーカーを含むことが多い。しかし、テトラサイクリンの使用に対する欠点は、環境への抗生物質の分布に対する懸念の高まりと、テトラサイクリンの検出は典型的に侵襲的であり、骨を得るために動物の歯の抽出または破壊を必要とする。サンプル20.ローダミンBは、種々の組織におけるマーカーとして評価されており、毛髪及びウィスカー10、21における紫外線(UV)光および蛍光を用いて検出することができる。
イオフェノキ酸(IPA)は、コヨーテ(Canislatrans)22、北極キツネ(ヴァルペス・ラゴプス)23、赤キツネ(ヴァルペス・ヴァルペス)24、アライグマの餌消費量を評価するために使用されている白色の結晶性粉末です。9,25、イノシシ14、赤鹿(セルヴス・エラフス・スコティカス)26、ヨーロッパのバッジ12およびフェレット(M.フロ)27、他のいくつかの哺乳類種の中で。IPAの保持時間は、一部のマーシャル28、29、無秩序26で少なくとも26週間、家畜犬で52週間以上(Canis lupus familiaris)30で2週間未満の種によって異なる。保持時間はまた、用量依存性31であってもよい。イオフェノキ酸は血清アルブミンに強く結合し、血中ヨウ素レベル32を測定することによって歴史的に検出された。この間接的アプローチは、UV検出33でイオフェノキ酸濃度を直接測定する高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)法に取って代わられ、最終的には液体クロマトグラフィーおよび質量分析(LCMS)を用いた。34、35。本研究では、多重反応モニタリング(MRM)を利用してイオフェノク酸の2つの類似体を定量化する、アンデム質量分析法(LC-MS/MS)法を用いた高感度かつ選択的液体クロマトグラフィーを開発した。私たちの目的は、このLC-MS/MS法を使用して、2-(3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨードベンジル)プロパニン酸(メチル-IPAまたはme-IPA)および2-(3-ヒドロキシ-2,4,6-トリリオドベンジル)ブタノイン酸(エチル-IPAまたはOR-IPA)およびAl-IPAのマーキング能力を評価することにした。捕獲マングースに餌。
マングースは、市販のスモークソーセージと魚油で餌付けされたケージトラップで捕獲されました。マングースは、個々の60 cm x 60 cm x 40 cmステンレス鋼ケージに収容され、約50gの市販の乾燥キャットフードの毎日の配給を供給し、市販の鶏もも肉で週2回補充した。水はアドリビタムを利用できました。我々は、IPAの2つの誘導体、エチル-IPAおよびメチル-IPAをプラセボORV餌で捕獲マングースに送達した。すべての餌は、粉末状の鶏卵とゼラチン(材料の表)を含む外部コーティング(以下「餌マトリックス」)を含む28mm x 20mm x 9mm箔ブリスターパックで構成されました。餌は0.7mLの水またはIPA誘導体を含み、約3gの重量を量り、そのうち約2gは外部餌マトリックスであった。
我々は3つの濃度で16捕獲マングースet-IPAを提供しました: 0.14% (2.8 mg et-IPA〜2g餌マトリックス; 3 オス [m],3 メス [f]], 0.4% (0.7 mL ブリスターパック体積で 2.8 mg et-IPA; 3m, 3f), 1.0% (0.7 mL ブリスターパック体積で 7.0 mg エチル-IPA; 2m)、2f)。2.8 mgの全体的な用量は5 mg/kg 27,36の用量率に対応し、プエルトリコで560gの平均マングース重量に基づいています。我々は、研究がいくつかのバイオマーカーに対する味の嫌悪感が一部の種で発生する可能性があることを示唆しているように、最高濃度として1%を選択しました >1%は、いくつかの種37で発生する可能性があります。我々は、凝集が十分に溶媒に溶解するのを防ぎ、餌マトリックスに均等に組み込まれるのを防ぐため、ブリスターパック内の1%の用量のみを提供した。1つの対照群(2m、1f)は、無菌水とIPAなしで満たされた餌を受け取った。私たちは、毎日のメンテナンス配給の間または前に午前中(〜午前8時)にマングースに餌を提供しました。餌の残骸は約24時間後に取り除かれた。治療前に血液サンプルを採取し、治療後1日、治療後8週間まで毎週採取した。我々は、イソムランガスの吸入によってマングースを麻酔し、フェレット38について説明するように頭蓋静脈カバの静脈穿刺によって全血の1.0 mLまで集めた。全血サンプルを遠心分離し、血精膜を凍結物に移し、分析するまで-80°Cで保存した。すべての動物が、繰り返し発生する血液が動物の健康に与える影響を最小限に抑えるために、すべての期間中にサンプリングされたわけではありません。対照動物を0日目にサンプリングし、その後毎週最大8週間の治療後にサンプリングした。
私たちは、0.035%(0.7mg)、0.07%(1.4mg)、0.14%(2.8mg)の3つの濃度でme-IPAを送達し、いずれも餌マトリックスに組み込まれ、治療群当たり2人の男性と2人の女性を含む。2人の男性と2人の女性は、無菌の水で満たされた餌を受け取り、IPAはありません。餌提供時間とマングース麻酔は、上記で説明します。1日目に治療前に血液サンプルを採取し、治療後4週間まで毎週採取した。
異なる治療群の血清IPA濃度の正常性と推定手段について血清濃度データを試験した。我々は、線形混合モデルを使用して、個人間でプールされた平均血清et-IPA濃度を比較した。餌型(マトリックス/ブリスターパック)は実験日に加えて固定効果であったのに対し、動物IDはランダム効果であった。すべての手順は、共通の統計ソフトウェア(材料の表)を使用して実行され、有意性はα= 0.05で評価された。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究のために開発されたLC-MS/MS法は、マングース血清中のme-IPAおよびet-IPAを正確に定量するために、多重反応モニタリングの選択性を利用した。MS/MS検出の選択性はまた、分析前に血清からタンパク質を沈殿させるアセトニトリルのみに依存する簡単なクリーンアッププロトコルを可能にしました。
イオフェノキ酸はACNに溶け込みますが、実質的に水中に不溶性です。ACN?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国農畜動植物衛生検査局、野生生物サービス、国立狂犬病管理プログラム、IDTビオロジカ(ドイツ・デッサウ・ロスラウ)の内部研究プログラムの一部によって支援されました。
Materials
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
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