Analyse von Iophenoxic Acid Analoga in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera zur Verwendung als orale Tollwut-Impfung Biologischer Marker

Das Tollwutvirus (RABV) ist ein einsträngiges Lyssavirus mit negativem Sinn und zirkuliert zwischen verschiedenen Tierreservoirarten innerhalb der Ordnungen Carnivora und Chiroptera. Mehrere Arten von Mongoose sind Reservoirs von RABV, und die kleine indische Mongoose (Herpestes auropunctatus) ist das einzige Reservoir in Puerto Rico und anderen karibischen Inseln in der westlichen Hemisphäre^1,2,3 . Die Kontrolle der RABV-Zirkulation in Wildtierreservoirs erfolgt in der Regel durch eine Strategie der oralen Tollwutimpfung (ORV). In den Vereinigten Staaten (USA) wird diese Management-Aktivität vom USDA/APHIS/Wildlife Services National Tollwut Management Program (NRMP)⁴koordiniert. Derzeit gibt es kein OrV-Programm für Wildtiere in Puerto Rico. Die Forschung an Tollwut-Impfstoffen und verschiedenen Ködertypen für Gänse wurde mit vielversprechenden Ergebnissen durchgeführt, die darauf hindeuten, dass ein ORV-Programm für Gänse möglich ist^5,6,7,8.

Die Überwachung der Auswirkungen von ORV beruht auf der Schätzung der Köderaufnahme durch Zielarten, was in der Regel die Bewertung einer Veränderung der RV-Antikörperseroprävalenz beinhaltet. Diese Strategie kann jedoch in Gebieten mit aktiven ORV-Programmen für Wildtiere oder in Gebieten, in denen RV enzootisch ist und die Hintergrundniveaus von RABV-neutralisierenden Antikörpern (RVNA) in Reservoir-Arten vorhanden sind, eine Herausforderung darstellen. In solchen Situationen kann ein Biomarker, der im Köder oder in der externen Ködermatrix enthalten ist, nützlich sein.

Verschiedene biologische Marker wurden verwendet, um die Aufnahme von Ködern bei zahlreichen Arten zu überwachen, einschließlich Waschbären (Procyon Lotor)^9,10, Stoats (Mustela ermine)^11,12, Europäische Dachse ( Meles meles) ¹³, Wildschweine (Sus scrofa)¹⁴, kleine indische Gänse¹⁵ und Präriehunde (Cynomysludovicianus)^16,17, u.a. In den USA enthalten operative ORV-Köder oft einen 1% Tetracyclin-Biomarker in der Ködermatrix, um die Köderaufnahme^18,19zu überwachen. Zu den Nachteilen bei der Verwendung von Tetracyclin gehört jedoch die wachsende Sorge über die Verteilung von Antibiotika in die Umwelt und dass der Nachweis von Tetracyclin typischerweise invasiv ist, was eine Zahnextraktion oder -zerstörung des Tieres erfordert, um Knochen zu erhalten. Proben²⁰. Rhodamine B wurde als Marker in einer Vielzahl von Geweben bewertet und kann mit ultraviolettem (UV) Licht und Fluoreszenz in Haaren und Schnurrhaaren^10,21nachgewiesen werden.

Iophenoxsäure (IPA) ist ein weißes, kristallines Pulver, das verwendet wurde, um köderlichen Verbrauch in Kojoten zu bewerten (Canis latrans)²², polarer Fuchs (Vulpes lagopus)²³, Rotfuchs (Vulpes vulpes)²⁴, Waschbären ^{9 , 25}, Wildschwein¹⁴, Rotwild (Cervus elaphus scoticus)²⁶, Europäische Dachse¹² und Frettchen (M. furo)²⁷, unter mehreren anderen Säugetierarten. Retentionszeiten von IPA variiert nach Arten von weniger als zwei Wochen in einigen Beuteltieren^28,29, bis mindestens 26 Wochen in Huftieren²⁶ und über 52 Wochen bei Haushunden (Canis lupus familiaris)³⁰. Retentionszeiten können auch dosisabhängig^{sein 31}. Iophenoxsäure bindet stark an Serumalbumin und wurde historisch durch Messung des Jodspiegels im Blut³²nachgewiesen. Dieser indirekte Ansatz wurde durch Hochleistungsmethoden zur Flüssigchromatographie (HPLC) zur direkten Messung der Iophenoxsäurekonzentrationen mit UV-Detektion³³und schließlich mit Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie (LCMS) ^{ersetzt. 34,35}. Für diese Studie wurde eine hochempfindliche und selektive Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Methode entwickelt, die multiple Reaction Monitoring (MRM) nutzt, um zwei Analoga von Iophenoxsäure zu quantifizieren. Unser Ziel war es, mit dieser LC-MS/MS-Methode die Markierungsfähigkeit von 2-(3-Hydroxy-2,4,6-Triiodobenzyl)Propansäure (Methyl-IPA oder me-IPA) und 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl)butansäure (ethyl-IPA oder et-IPA) und Köder an gefangene Gänse.

Die Gänse wurden in Käfigfallen, die mit handelsüblichen Räucherwürsten und Fischöl geködert wurden, live gefangen. Die Gänse wurden in einzelnen 60 cm x 60 cm x 40 cm Edelstahlkäfigen untergebracht und mit einer täglichen Ration von 50 g gewerblichem Trockenkatzenfutter von 50 g gefüttert, zweimal pro Woche mit einem handelsüblichen Hühnerschenkel ergänzt. Wasser war verfügbar ad libitum. Wir lieferten zwei Derivate von IPA, Ethyl-IPA und Methyl-IPA, an gefangene Mongos in Placebo-ORV-Ködern. Alle Köder setzten sich aus einer 28 mm x 20 mm x 9 mm Folienblisterpackung mit einer externen Beschichtung(nachfolgend “Ködermatrix”) mit pulverisiertem Hühnerei und Gelatine (Materialtabelle) zusammen. Köder enthielten 0,7 ml Wasser oder IPA-Derivat und wogen etwa 3 g, von denen 2 g die externe Ködermatrix war.

Wir boten 16 in Gefangenschaft gehaltene Mongooses et-IPA in drei Konzentrationen an: 0,14% (2,8 mg et-IPA in 2 g Ködermatrix; 3 Männchen [m], 3 Weibchen [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA in 0,7 ml Blisterpackungvolumen; 3m, 3f) und 1,0% (7,0 mg Ethyl-IPA in 0,7 ml Blisterpackung; 2 , 2f). Die Gesamtdosis von 2,8 mg entspricht einer Dosis von 5 mg/kg^27,36 und basiert auf einem durchschnittlichen Gänsegewicht von 560 g in Puerto Rico. Wir wählten 1% als höchste Konzentration, da die Forschung darauf hindeutet, dass Geschmacksaversion zu einigen Biomarkern in Konzentrationen von >1% bei einigen Arten auftreten kann³⁷. Wir boten nur die 1%-Dosis in der Blisterpackung an, da die Flockung verhinderte, dass sich die Lösung im Lösungsmittel ausreichend auflöste, um gleichmäßig in die Ködermatrix eingearbeitet zu werden. Eine Kontrollgruppe (2m, 1f) erhielt Köder, die mit sterilem Wasser und ohne IPA gefüllt waren. Wir boten Den Gänsen morgens (ca. 8 Uhr) während oder vor der Fütterung ihrer täglichen Pflegeration Köder an. Köderreste wurden nach etwa 24 Stunden entfernt. Wir sammelten Blutproben vor der Behandlung, einen Tag nach der Behandlung und dann wöchentlich bis zu 8 Wochen nach der Behandlung. Wir anästhetisierten Mongooses durch Einatmen von Isoflurangas und sammelten bis zu 1,0 ml Vollblut durch Venipunktion der Schädelvenenhöhle, wie für Frettchen beschrieben³⁸. Wir zentrifugierten Vollblutproben, übertrugen Seren auf Kryovials und lagerten sie bis zur Analyse bei -80 °C. Nicht alle Tiere wurden in allen Zeiträumen beprobt, um die Auswirkungen wiederholter Blutentnahmen auf die Gesundheit der Tiere zu minimieren. Kontrolltiere wurden am Tag 0, dann wöchentlich für bis zu 8 Wochen nach der Behandlung beprobt.

Wir lieferten me-IPA in drei Konzentrationen: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) und 0,14% (2,8 mg), alle in die Ködermatrix integriert, mit 2 Männern und 2 Frauen pro Behandlungsgruppe. Zwei Männchen und zwei Weibchen erhielten Köder, die mit sterilem Wasser und ohne IPA gefüllt waren. Köder, die Zeiten und Mongooseanästhesie anbieten, werden oben beschrieben. Wir sammelten Blutproben vor der Behandlung am ersten Tag, und dann wöchentlich bis zu 4 Wochen nach der Behandlung.

Wir haben Serumkonzentrationsdaten auf Normalität und geschätzte Mittel für Serum-IPA-Konzentrationen verschiedener Behandlungsgruppen getestet. Wir verwendeten ein lineares gemischtes Modell, um mittlere Serum- und IPA-Konzentrationen zu vergleichen, die über Individuen gepoolt wurden. Der Ködertyp (Matrix/Blisterpackung) war neben dem Versuchstag ein fester Effekt, während die tierische ID ein Zufallseffekt war. Alle Prozeduren wurden mit einer gemeinsamen statistischen Software (Tabelle der Materialien) durchgeführt und die Signifikanz wurde mit 0,05 bewertet.