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Genetics

Isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza

Published: May 07, 2019
doi:
10.3791/59372
, ,
1Skin, Endothelium Research Division, Department of Dermatology,Medical University of Vienna

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo basato su FACS per l’isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana. Si aggira in vitro cultura che era inevitabile con il protocollo di isolamento comunemente usato attraverso le colture espianti. I sottogruppi di fibroblasti emananti sono funzionalmente distinti e mostrano l’espressione genica differenziale e la localizzazione all’interno del derma.

Abstract

I fibroblasti sono una popolazione cellulare altamente eterogenea implicata nella patogenesi di molte malattie umane. Nel derma cutaneo umano, i fibroblasti sono stati tradizionalmente attribuiti al derma superficiale papillare o inferiore reticolare secondo la loro localizzazione istologica. Nel derma del topo, i fibroblasti papillari e reticolari provengono da due diversi lignaggi con funzioni divergenti per quanto riguarda i processi fisiologici e patologici e un profilo di espressione di marcatore di superficie cellulare distinto con cui possono essere distinti.

È importante sottolineare che le evidenze provenienti da colture espianti da strati cutanei superficiali e inferiori suggeriscono che almeno due linee di fibroblasti dermici funzionalmente distinti esistono anche nel derma cutaneo umano. Tuttavia, a differenza della pelle del topo, i marcatori di superficie cellulare che consentono la discriminazione di diversi sottogruppi di fibroblasti non sono ancora stati stabiliti per la pelle umana. Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per l’isolamento delle popolazioni di fibroblasti papillari e reticolari umani tramite la selezione di cellule attivate a fluorescenza (FACS) utilizzando i due marcatori di superficie cellulare proteina di attivazione fibroblast (FAP) e antigene di thymocyte 1 (Thy1)/CD90. Questo metodo consente l’isolamento di sottogruppi di fibroblasti puri senza manipolazione in vitro, che ha dimostrato di influenzare l’espressione genica, permettendo così un’accurata analisi funzionale dei sottogruppi di fibroblasti cutanei umani per quanto riguarda l’omeostasi tissutale o la malattia patologia.

Introduction

Come principale componente cellulare del tessuto connettivo, i fibroblasti sono principalmente responsabili della deposizione di collagene e fibre elastiche che in ultima analisi formano la matrice extracellulare1, e quindi il loro ruolo nell’omeostasi tissutale, nella rigenerazione e malattia è stata sottovalutata da molto tempo. Tuttavia, i fibroblasti sono recentemente venuti sotto i riflettori dei ricercatori, non solo perché rappresentano una fonte cellulare prominente per le cellule staminali pluripotenti indotte2 ma anche a causa della loro elevata plasticità e implicazione nella patogenesi della un ampio numero di malattie come la fibrosi degli organi3,4,5 o il cancro6,7.

La pelle umana è composta da un epitelio a più strati, l’epidermide e il suo tessuto connettivo sottostante, il derma, che può essere istologicamente suddiviso nel papillare superiore e nel derma reticolare inferiore ed è composto principalmente da fibroblasti e matrice extracellulare8 e l’ipoderma. Secondo la loro posizione all’interno del tessuto, i fibroblasti dermici sono stati approssimativamente classificati nei fibroblasti papillari e reticolari1.

È importante sottolineare che i dati recenti indicano che queste sottopopolazioni di fibroblasti dermici non sono solo istologicamente distinguibili, ma anche che la loro funzione è considerevolmente diversificata. Nella pelle del topo, i fibroblasti papillari e reticolari derivano da due linee distinte durante l’embriogenesi9. Diverse linee di prova suggeriscono che i due lignaggi esercitano ruoli diversi non solo nell’omeostasi tissutale, nella morfogenogenesi dei follicoli, nella riparazione delle ferite e nella fibrosi7,9,10, ma rispondono anche a diversi segnali provenienti da cellule staminali epidermiche neoplastiche11, suggerendo ruoli divergenti nella patogenesi del cancro. Convenientemente, entrambi i lignaggi esprimono un insieme distinto di marcatori cellulari reciprocamente esclusivi nella pelle del topo adulto, permettendo così l’isolamento di popolazioni di fibroblasti puri dermici e successive analisi approfondite delle loro specifiche funzioni in vitro9 , 11. la

Corrispondentemente, almeno due sottogruppi distinti di fibroblasti con morfologia e funzioni distinte, compresi i tassi di proliferazione divergenti, le capacità di rimodellamento dei tessuti12,13, nonché la capacità di sostenere la crescita di cellule staminali epidermiche in vitro, sono state descritte per la pelle umana derma14,15. Tuttavia, la maggior parte degli studi pubblicati sui fibroblasti cutanei umani sono stati condotti utilizzando popolazioni miste di fibroblast isolate da colture espianti dalla pelle dermatata, poiché set di marker di superficie cellulare specifici che consentono l’isolamento di pura papillare umana o le sottopopolazioni di fibroblasti reticolari in analogia al derma del topo dovevano ancora essere stabilite.

Recentemente abbiamo dimostrato che i fibroblasti papillari e reticolari della pelle umana sono caratterizzati da specifici marcatori di superficie cellulare che consentono l’isolamento delle rispettive sottopopolazioni tramite la selezione di cellule attivate a fluorescenza (FACS)16: FAP + CD90– fibroblasti rappresentano fibroblasti papillari situati principalmente nel derma superiore, presentando tassi di proliferazione più elevati, una firma genica distinta ma nessun potenziale adipogenico. FAP+CD90+ e FAP–CD90+ fibroblasti appartengono alla stirpe reticolare dei compartimenti dermici inferiori, che sono meno proliferativa ma prontamente subiscono adipogenesi — un segno distintivo per i fibroblasti reticolari. Questo metodo consente di studiare ampiamente queste sottopopolazioni di fibroblasti distinti non solo per quanto riguarda le loro funzioni specifiche in condizioni fisiologiche, ma anche nel contesto della patogenesi delle malattie cutanee, compreso il cancro della pelle.

Tuttavia, poiché i fibroblasti alterano la loro espressione di marker di superficie cellulare in colture bidimensionali in vitro16,17,19, l’applicazione del nostro protocollo è limitata all’isolamento dei fibroblasti primari da esseri umani non consente l’identificazione di fibroblasti papillari o reticolari nelle popolazioni di colture cellulari miste. È importante sottolineare che, sebbene l’espressione dei marcatori di superficie cellulare cambi in vitro, abbiamo dimostrato che i sottogruppi di fibroblasti isolati secondo il protocollo descritto di seguito mantengono la loro funzionalità specifica quando sono coltivati a16, permettendo così studi in vitro di proprietà specifiche di un sottoinsieme in condizioni fisiologiche o patologiche.

In conclusione, abbiamo sviluppato un protocollo per l’isolamento di distinti sottogruppi di fibroblasti tramite FACS che per la prima volta permette l’isolamento delle popolazioni di fibroblasti puri dal derma cutaneo umano in uno stato ingenuo.

Protocol

La pelle umana è stata ottenuta da uomini e donne caucasici di età compresa tra 26 e 61 anni (pelle protetta dal sole; correzioni addominali, riduzioni del seno). Il consenso scritto informato del paziente è stato ottenuto prima della raccolta dei tessuti in conformità con la dichiarazione di Helsinki e con l’approvazione del Comitato di revisione istituzionale dell’Università di medicina di Vienna. Nota: Forniamo un protocollo per l’isolamento delle sottopopolazioni di fibroblasti funzionalmente distinte sia dal derma a pieno spessore (fare riferimento al paragrafo 1) o dopo il sezionamento del derma cutaneo umano nei suoi diversi strati (saltare la sezione 1 e fare riferimento direttamente al paragrafo 2) . 1. preparazione del derma a pieno spessore Posizionare un pezzo di pelle umana di 10 cm x 10 cm (ad esempio, da correzioni addominali o riduzioni del seno) con l’epidermide rivolta verso il basso su carta filtrante spessa. Tenere l’epidermide saldamente sui suoi bordi con pinze e rasare lo strato di grasso sottocutaneo con un bisturi. Quindi tagliare il tessuto in strisce larghe 5 mm prima di metterli in una capsula di Petri.Nota: Ciò facilita la penetrazione di dispase II (indicato come enzima dissociante d’ora innanzi, vedere paragrafo 3) e viene utilizzato se l’epidermide deve essere separata dall’intero derma. Per questo saltare la sezione 2 e fare riferimento direttamente alla sezione 3. Per evitare contaminazioni, mantenere il tessuto sterile dopo la rimozione chirurgica o pulirlo accuratamente con etanolo o soluzione di iodio. Se a tutti, il trattamento con etanolo della superficie cutanea provoca solo la morte delle cellule minori. Lavorare in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale. 2. sezionamento del derma cutaneo umano in strati papillari e reticolari con un Dermatoma Posizionare un pezzo di pelle di 10 cm x 10 cm (ad esempio, da correzioni addominali o riduzioni del seno) su carta filtrante spessa, con l’epidermide rivolta verso l’alto. Tenere la pelle saldamente sui suoi bordi con pinze. Affettare la pelle con un dermatoma elettrico, regolato a uno spessore di taglio/profondità di 300 μm, facendo scivolare la testa del dermatome lontano da se stessi, con la lama essendo ad un angolo di 90 ° rispetto alla superficie della pelle. Prendere il primo strato costituito da epidermide e derma papillare (300 μm di spessore, “strato cutaneo 1”, Figura 1 e Figura 2) e metterlo in una capsula di Petri. Procedere immediatamente alla sezione 3 o aggiungere 1X PBS per evitare che il tessuto si asciuga.Nota: Per evitare la contaminazione, mantenere il tessuto sterile dopo la rimozione chirurgica o pulirlo accuratamente con etanolo o soluzione di iodio. Lavorare in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale.Attenzione: Maneggiare con cura il dermatoma poiché le lame sono molto affilate. Ripetere il passo 2,2 regolando il dermatoma ad uno spessore di taglio di 700 μm e affettare il derma rimanente. Posizionare la porzione superiore che è definita come il derma reticolare superiore (“strato cutaneo 2”, Figura 2) in una capsula di Petri separata. Procedere immediatamente alla sezione 4 o aggiungere 1X PBS per evitare che il tessuto si asciuga. Grattare via lo strato di grasso sottocutaneo con un bisturi dallo strato dermico residuo inferiore reticolare (> 1000 μm) e scartarlo. Raccogliere il derma reticolare inferiore (“strato cutaneo 3”, Figura 2) in un’altra capsula di Petri. Procedere immediatamente alla sezione 4 o aggiungere 1X PBS per evitare che il tessuto si asciuga.Nota: In alternativa, invece di rasare il grasso con un bisturi, rimuovere lo strato di grasso con le forbici. Può aiutare a mettere il derma reticolare sul ghiaccio prima di rasare il grasso di distanza. 3. separazione dell’epidermide e del derma Preparare un enzima di dissociazione 3 U/mL (cioè, Dispase II) in sterile 1X PBS. Posizionare le strisce cutanee da 5 mm (dal paragrafo 1) o l’epidermide/derma papillare (dal punto 2,2), con l’epidermide rivolta verso l’alto in una capsula di Petri da 10 cm con 10 mL di soluzione enzimatica dissociante da 3 U/mL. Incubare la capsula di Petri a 37 ° c per 1 ora. Il protocollo può essere sospeso qui. Incubare l’epidermide/derma papillare in proteasi in frigorifero a 4 ° c durante la notte. Se necessario conservare gli altri strati (strato cutaneo 1, 2 e 3) durante la notte immersi in 1X PBS in 50 mL tubi a 4 ° c.Attenzione: Lavorare con cautela con la proteasi, può irritare la pelle e gli occhi al contatto. Dopo l’incubazione, trasferire l’epidermide/derma papillare al coperchio asciutto della capsula di Petri e separare l’epidermide dal derma superiore (strato dermico 1) con due pinze ciascuna tenendo il bordo dell’epidermide o del derma. 4. digestione enzimatica del tessuto cutaneo Tritare ogni strato dermico (strato dermico 1, 2 e 3) separatamente con forbici/bisturi il più accuratamente possibile; più piccoli sono i pezzi, migliore è la digestione dei tessuti.Nota: La tenacità del derma può variare a seconda della parte del corpo da cui proviene (ad esempio, la pelle addominale o superiore del braccio). Preparare il mix di digestione combinando 1,25 mg/mL di collagenasi I, 0,5 mg/mL di collagenasi II, 0,5 mg/mL di collagenasi IV e 0,1 mg/mL di ialuronidasi nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con L-Glutammina (vedere tabella dei materiali), 10% siero di vitello fetale ( FCS) e 1% di penicillina/streptomicina (P/S).Attenzione: Lavorare con cura con collagenasi in quanto questi possono irritare la pelle e gli occhi al contatto. Mettere ciascuno dei tessuti tritati con 10 mL di miscela di digestione preparata in un 50 mL di tubo e incubare in un 37 ° c bagnomaria calda per 1 h in agitazione permanente. Durante la digestione invertire i tubi più volte.Nota: Si dovrebbe prendere in considerazione la regolazione del volume di digestione in base alle dimensioni del pezzo di pelle macinata. Non sovraccaricare 10 mL di miscela di digestione con troppi tessuti altrimenti la resa delle cellule sarà minima. Si raccomanda meno di un terzo del tessuto nel volume totale (1:2 w/v). 5. preparazione della sospensione a singola cellula e della lisi eritrocitaria Fermare la digestione enzimatica del tessuto aggiungendo 10 mL di mezzo di fibroblasti (DMEM con L-glutamina, 10% FCS e 1% P/S) al tessuto digerito. Lavorare sul ghiaccio da qui in poi. Versare il contenuto di ogni tubo attraverso un normale filtro di tè in acciaio inox sterile e raccogliere la sospensione cellulare in una capsula di Petri pulita. Lavare il filtro con un mezzo e schiacciare i pezzi di tessuto non digeriti con il bordo di una siringa-stantuffo. Successivamente, la pipetta ha raccolto la sospensione cellulare attraverso un filtro a cellule da 70 μm in un tubo da 50 mL. Sciacquare il filtro cellulare con il mezzo e raccogliere il flusso attraverso lo stesso tubo. Provette centrifughe a 500 x g a 4 ° c per 10 min. rimuovere e scartare il pellet supernatante e di lavaggio con 5 ml di fibroblasti. Ripetere la fase di centrifugazione. Rimuovere e scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi eritrocitica ACK autoprodotto (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3, 0,1 mm na2EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4). Lasciare le cellule in tampone di lisi per circa 1 min a temperatura ambiente (20 \ u201222 ° c). Arrestare la lisi aggiungendo 9 mL di 1X PBS con 10% FCS e centrifugare nuovamente i tubi a 500 x g a 4 ° c per 5 min. eliminare il surnatante.Attenzione: Il tempo di incubazione nella lisi degli eritrociti può essere regolato se la lisi sembra incompleta (pellet rosso). Tuttavia, non lasciare le cellule nel tampone di lisi eritrocitte per troppo tempo per evitare la lisi dei fibroblasti e delle cellule immunitarie. 6. fibroblasti di blocco e colorazione per FACS Preparare 5 μL di soluzione di blocco del recettore FC umano in 100 μL di 1X PBS con 10% di FCS e risospendere le cellule in 100 μL di FC Blocker umano. Incubare su ghiaccio per 10 min. Progettare un pannello di colorazione FACS per macchiare i fibroblasti cutanei umani. Mix anti-umano FAP APC (1:20), anti-umano CD90 DETERMINATORE AF700 (1:30), anti-umano E-cadherin PE (1:20), anti-umano CD31 FITC (1:30), anti-umano CD45 Pacific Blue (1:20), Anti-Human ITGA6 PE (1:20), anti-umano CD235ab Pacific Blue (1:1000) e anti-human CD106 Pacific blu (1:100) in 1X PBS con 10% FCS. Dopo il blocco del recettore FC, le cellule di spin verso il basso a 500 x g a 4 ° c per 3 minuti rimuovere e scartare il supernatante e risospendere le cellule in 100 μl di miscela di anticorpi. Incubare le cellule al buio a 4 ° c per 20 min. Prima della colorazione, rimuovere 20 μL di un campione con un numero elevato di cellule per controlli FACS non colorati e a macchia singola. Lavare le cellule macchiate e i controlli FACS due volte con 500 μL 1X PBS con 10% FCS e centrifugare a 500 x g a 4 ° c per 3 min. Nel frattempo, aggiungere 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a 1X PBS con 10% FCS per effettuare una concentrazione finale di 1 μg/mL. Rimuovete e scartate i supernatanti, risospendi le cellule in 200 μL di soluzione DAPI e filtrate ogni sospensione cellulare attraverso un filtro a cellule da 70 μm in un tubo FACS da 5 mL.Nota: Se FACS sta per essere eseguita con ritardo, aggiungere DAPI e filtrare poco prima della registrazione. 7. strategia di gating per l’isolamento del sottogruppo di fibroblasti cutaneo umano e FACS Controlli della citometria del flusso di registrazione, impostare le impostazioni di tensione corrette ed eseguire la compensazione appropriata. Cancello per cellule singole e cellule negative Live (DAPI-), Blu Pacifico, PE e FITC (CD45-, CD31-, CD235ab-, CD106-, ITGA6- e e-cadherin-) per ottenere tre popolazioni di fibroblasti: FAP+ CD90-, FAP+CD90+ e le celle FAP-CD90+ . Vedere la Figura 3. Ordina tre sottopopolazioni di fibroblasti in provette da microcentrifuga a tappo a vite da 1,5 mL separate riempite con tampone di lisi da 350 μL per l’isolamento dell’RNA o riempite con 350 μL di mezzo di crescita fibroblastica (vedere la tabella dei materiali) per la coltura cellulare. Invertire i tubi immediatamente dopo il tipo e sia mettere i tubi tampone di lisi in azoto liquido per il congelamento a scatto o mettere tubi medi sul ghiaccio.Attenzione: Preparare tampone di lisi con 0,1% b-mercaptoetanolo nella cappa fumi ed evitare l’inalazione. 8. coltura di fibroblasti e saggio di adipogenesi A seguito di FACS, le celle di spin abbassano a 500 x g per 3 min a 4 ° c e i numeri di cella uguali (5000 \ u201210 cellule/pozzo) nel mezzo di crescita dei fibroblasti (vedere la tabella dei materiali) in 48-ben piatti di coltura cellulare. Lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere il 70% di confluenza. Aggiungere 5 μg/mL di insulina, 5 μM di troglitazone, 0,5 mM 3-isobutilil-1-metilxantina (IBMX) e 1 μM di dexametasone al mezzo di crescita del fibroblasto per preparare il mezzo di differenziazione adipociti. Sostituire il mezzo delle cellule coltivate con il mezzo di differenziazione degli adipociti e lasciare che le cellule si differenziano per 14 giorni. Mezzo di scambio dopo il giorno 2 con un mezzo di adipogenesi ridotto contenente 5 μg/mL di insulina e 5 μM di troglitazone. Ricostituire il mezzo ogni 3Rd o 4° giorno. Fissare le celle con il 4% di PFA per 20 minuti a temperatura ambiente (20 \ u201222 ° c) al giorno di differenziazione 14. Lavare i pozzetti con 60% di isopropanolo e lasciarlo evaporare completamente. Colorare le cellule con 5 mM olio rosso O (filtro prima dell’uso) per 20 min. lavare le cellule macchiate quattro volte con acqua distillata. Procedere per eseguire la microscopia.Attenzione: PFA è tossico e nocivo. Maneggiare con cautela.Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Le celle fisse possono essere memorizzate in 1X PBS a 4 ° c fino a quando non viene eseguita la colorazione dell’olio rosso. Coprire il piatto con pellicola di paraffina prima dello stoccaggio per evitare l’evaporazione. Celle d’immagine immerse in acqua con microscopio invertito a ingrandimento 10x con luce trasmessa.

Representative Results

Una panoramica dei passaggi principali per l’elaborazione del tessuto cutaneo per ottenere una sospensione a singola cellula è mostrata nella Figura 1, mostrando il dermatoming della pelle (Figura 1a), diversi strati dermici (Figura 1B), la rimozione del grasso sottocutaneo strato (Figura 1C) e la separazione dell’epidermide e del derma papillare (Figura 1D), nonché le diverse fasi della dissociazione manuale ed enzimatica del tessuto (Figura 1e, F). Uno schema dei tre strati dermici è fornito in Figura 2. Figura 3 Mostra la strategia di gating di un pannello di colorazione citometria di flusso per l’analisi di diversi sottogruppi di fibroblasti dalla pelle umana. Ulteriori marcatori di superficie cellulare che non sono espressi sui fibroblasti consentono l’esclusione di varie altre cellule presenti nella pelle come le cellule immunitarie, le cellule epidermiche, le cellule staminali mesenchimali (MSC), i globuli rossi o le cellule endoteliali per raggiungere la massima purezza nelle popolazioni isolate. Non è fondamentale utilizzare il pannello FACS identico utilizzato nella Figura 2 per l’identificazione di queste sottopopolazioni fibroblasti, tuttavia questa è la nostra raccomandazione. Si possono usare anticorpi etichettati con coloranti fluorescenti differenti o alterare la combinazione di marcatori di esclusione. Di nota, questo protocollo consente l’identificazione di tre popolazioni di fibroblasti nella pelle umana che presentano una diversa localizzazione intradermica, profili di espressione genica e anche funzioni (Figura 4). FAP+CD90- sono arricchiti nel derma papillare mentre FAP+CD90+ e FAP-CD90+ sono più abbondanti nel derma reticolare (Figura 4a). Tutte e tre le sottopopolazioni mostrano la morfologia tipica dei fibroblasti al momento dell’ordinamento nella coltura cellulare (Figura 4B). È interessante notare che differiscono per quanto riguarda la loro capacità di differenziare in adipociti che è un segno distintivo per i fibroblasti reticolari. Combinando questi risultati con la profilatura dell’espressione genica tramite la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR)16 (Figura 4c), mostrando che le cellule FAP+CD90 esprimono alti livelli di marcatori comunemente attribuiti a fibroblasti papillari come CD26, NTN e PDPN mentre CD90+ cellule esprimono i marcatori reticolari noti come CD36, ACTA2 e PPARγ ad alti livelli, CONCLUDIAMO che FAP+CD90- cellule appartengono al papillare e CD90+ le cellule appartengono al lignaggio reticolare. Figura 1: isolamento della sospensione cutanea a singola cellula dalla pelle umana intatta. (A) la pelle viene tagliata con un dermatoma elettrico nel derma papillare e reticolare. B) il derma papillare con epidermide adiacente è di 300 μm di spessore (superiore) mentre il derma reticolare superiore è di 700 μm di spessore (inferiore). (C) lo strato di grasso sottocutaneo è raschiato-off del derma reticolare inferiore con un bisturi. (D) dopo l’incubazione del derma papillare nella soluzione enzimatica di dissociazione a 37 ° c per 1 ora, l’epidermide può essere facilmente rimossa con pinze. E) diversi strati dermici sono tritati con le forbici e trasferiti in un mix di digestione enzimatica costituito da collagenasi I, II e IV e ialuronidasi. (F) dopo 1 h di dissociazione a 37 ° c, la digestione dei tessuti viene interrotta e la sospensione viene versata attraverso un colino da tè per rimuovere i pezzi di pelle non digeriti. (G) la sospensione cellulare viene filtrata una volta di più attraverso un filtro a cellule 70 μm e centrifugata a 500 x G a 4 ° c per 10 min. (H) dopo la centrifugazione, il pellet cellulare viene lavato con 1x PBS con 10% FCS ed è pronto per la colorazione dei FACS. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 2: sezionamento del derma cutaneo umano in strati papillari e reticolari con un dermatoma. Schema che mostra i tre strati dermici ottenuti mediante affettare la pelle a pieno spessore in derma papillare (compresa l’epidermide; 0 \ u2012300 μm; strato cutaneo 1), reticolare superiore (300 \ u20121 μm; strato cutaneo 2) e derma reticolare inferiore (> 1000 μm; strato dermico 3) con un dermatome. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 3: strategia di gating FACS per le sottopopolazioni di fibroblasti cutanei umani. (A\u2012e) In primo luogo, le cellule sono recintate su singole (B) e vitali (DAPI-) celle (C). Le cellule immunitarie (CD45+), le cellule staminali mesenchimali (CD106+), i globuli rossi (CD235ab+) sono escluse (C) e le cellule negative blu del Pacifico sono ulteriormente chiuse su e-cadherina (ECAD) e ITGA6 doppie cellule negative (canale PE, D ). E-cadherin e ITGA6 sono marcatori espressi su cellule epidermiche. Successivamente, sono escluse le cellule positive CD31-FITC (cellule endoteliali e linfatiche) (D) che hanno causato tre popolazioni di fibroblasti che esprimono uno o entrambi i marcatori fibroblasti di superficie delle due cellule FAP e CD90: FAP+CD90-, FAP+CD90+ e FAP-CD90+ (e). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 4: i fibroblasti FAP+CD90-, FAP+CD90+ e FAP-CD90+ differiscono nella localizzazione cutanea, nell’espressione genica e nella funzionalità. A) i lotti rappresentativi di fibroblasti di FACS isolati da derma papillare, reticolare superiore e inferiore reticolare. La strategia di gating è illustrata nella Figura 3. FAP+CD90- i fibroblasti sono arricchiti nel derma papillare (19,2%) rispetto al derma reticolare inferiore (0,83%). FAP+CD90+ cellule possono essere trovati in tutto il derma, ma la loro più alta abbondanza è nel derma reticolare superiore (40,7%). FAP-CD90+ sono arricchiti nel derma reticolare inferiore (64,4%). B) di nota, tutte e tre le sottopopolazioni classificate mostrano la morfologia tipica dei fibroblasti sulla coltura per 7 giorni (a sinistra). È interessante notare che si comportano in modo diverso in un saggio di adipogenesi. Dopo 14 giorni di cultura, FAP+CD90- non differenziarsi in adipociti mentre FAP+CD90+ e FAP-CD90+ prontamente subiscono adipogenesis (destra; Olio rosso O macchia le cellule lipidiche cuscinetto rosso). Barre di scala = 1.000 μm. (C) direttamente ordinatiFAP +CD90- fibroblasti esprimono i marcatori FIBROBLASTICI PAPILLARI CD26, NTN1 e PDPN, mentre FAP-CD90+ cells Express CD36, ACTA2 e PPARγ, noti per essere espressa dal lignaggio reticolare. * p ≤ 0,05; p ≤ 0,0005 rispetto alle celle FAP+/Cd90; # p ≤ 0,05; # # # p ≤ 0,0005 rispetto alle celle FAP-/CD90+ . Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Discussion

In questo articolo, descriviamo un metodo per l’isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana. CD90 è stato ampiamente utilizzato per l’identificazione o l’isolamento dei fibroblasti dermici18,20,21. Tuttavia, abbiamo dimostrato che oltre ai fibroblasti CD90 +, il derma umano ospita anche una popolazione CD90– fibroblastica che esprime FAP16, che è stata stabilita come marcatore per i fibroblasti attivati e i fibroblasti associati al cancro ( CAFS)22,23,24,25. È importante sottolineare che siamo stati in grado di identificare tre sottopopolazioni di fibroblasti FAP+CD90–, FAP+CD90+ e FAP–CD90+ nelle biopsie cutanee di tutti i donatori umani sani. Concludiamo quindi che FAP non è solo un marcatore per i fibroblasti attivati o i CAFs, ma anche i fibroblasti dei tessuti normali.

Di nota, la popolazione FAP–CD90– Cell rimasta dopo l’applicazione della strategia di esclusione e di gating sopra descritta non contiene fibroblasti, poiché queste cellule non proliferano nel mezzo di coltivazione fibroblastica in vitro, ma la maggior parte probabilmente una popolazione di cellule miste tra cui cellule linfatiche e periciti tra gli altri16.

La resa cellulare ottenuta con l’uso del protocollo sopra descritto può variare a seconda del corpo-parte che ha origine il pezzo di pelle utilizzato per l’isolamento. Dermis da diverse parti del corpo differisce per quanto riguarda la sua struttura, spessore e composizione di collagene. Ad esempio, la pelle dal viso o dalla parte superiore del braccio è molto più sottile della pelle dalla pancia o dalla coscia, che spesso mostrano anche uno strato di grasso sottocutaneo più spesso. Inoltre, l’età e il sesso dei donatori di pelle possono ulteriormente influire non solo sull’efficienza di dissociazione dei tessuti, ma possono anche influenzare la distribuzione delle tre sottopopolazioni di fibroblasti (Figura 3) quando isolate dalla pelle a pieno spessore. Ciò risulta dal fatto che il derma papillare si riduce e che i numeri di fibroblasti totali diminuiscono con11,26,27,28anni. Inoltre, il pellet cellulare dal derma papillare sarà probabilmente più grande rispetto al derma reticolare, poiché il derma superiore è più densamente popolato da fibroblasti rispetto al derma reticolare. Inoltre, il derma inferiore è anche più duro e più densamente imballato con il collagene, rendendo più difficile dissociare il tessuto e rilasciare i fibroblasti. Di nota, il pellet cellulare può apparire molto rosso, che è il motivo per cui si raccomanda la lisi dei globuli rossi.

Oltre all’identificazione di tre sottopopolazioni in pelle umana intatta, mostriamo anche che nella pelle dermatata, ogni sottogruppo di fibroblasti è arricchito sia nel derma papillare che reticolare16. L’affettamento preciso della pelle con il dermatoma è fondamentale per ottenere un adeguato arricchimento di ogni sottopopolazione da diversi strati dermici. Poiché il derma papillare è molto sottile, la fetta dermatata che lo rappresenta non deve superare uno spessore di 300 μm. i fibroblasti reticolari superiori e inferiori, entrambi rappresentano il lignaggio reticolare e mostrano funzioni e firme genetiche simili, Pertanto, si potrebbe anche considerare di non separarli.

È importante sottolineare che tutte e tre le popolazioni di fibroblasti si trovano in tutto il derma e non sono esclusivamente presenti in uno strato, motivo per cui le colture espianti dal derma papillare o reticolare provocano colture fibroblastiche miste. Tuttavia, il fibroblasto FAP+CD90– papillare è più abbondante nel derma papillare e segue un gradiente da strati superficiali a quelli cutanei più bassi mentre i fibrosi FAP+CD90+ e FAP–CD90+ seguono un Gradiente inverso dagli strati inferiori a quelli superficiali16. Inoltre, la maggior parte dei CD90+ fibroblasti del derma papillare si trovano quasi esclusivamente nei vasi sanguigni circostanti ed esprimono il marcatore fibroblasto perivascolare CD14629, e quindi probabilmente presentano funzioni diverse rispetto al restanti fibroblasti CD146– reticolari16. CD146 potrebbe essere utilizzato come marcatore aggiuntivo nella strategia di gating per escludere questa popolazione.

Dopo la dissociazione degli strati dermici, le cellule isolate sono macchiate con un cocktail anticorpale appositamente progettato contenente vari anticorpi per l’esclusione delle cellule immunitarie, delle cellule endoteliali e linfatiche, delle cellule epidermiche, degli eritrociti e degli msc per ottenere popolazioni di fibroblasti puri. Di nota, la scelta di un marcatore per l’identificazione e l’esclusione di MSCS può essere difficile a causa dell’elevato numero di marcatori MSC pubblicati30,31. Poiché le MSCs esprimono CD90 come i fibroblasti, ulteriori marcatori MSC come CD105 o CD271 potrebbero rivelarsi utili per la loro identificazione. Tuttavia, le MSCs rappresentano solo una percentuale molto bassa di tutte le cellule dermiche e poiché i fibroblasti CD90+ presentano caratteristiche morfologiche tipiche dei fibroblasti al momento della cernita, si potrebbe sostenere che l’esclusione di MSCS mediante l’uso di marcatori di superficie cellulare distinti potrebbe essere inutili.

È importante sottolineare che abbiamo analizzato l’espressione genica FAP e CD90 dopo aver mantenuto le cellule in coltura per 7-14 giorni dopo l’ordinamento (dati non mostrati) e trovato che l’espressione di entrambi i marcatori è aumentata nel rispettivo singolo positivo ordinato (FAP+CD90– o FAP–CD90+) celle16. Sottolineiamo quindi che i set di marcatori e il protocollo sopra descritti consentono l’isolamento dei sottogruppi di fibroblasti primari direttamente dal tessuto, ma non da popolazioni di fibroblasti misti precedentemente coltivate.

Tuttavia, si dimostra che la funzionalità di tutte e tre le sottopopolazioni viene mantenuta nella coltura cellulare indipendentemente dall’alterazione dell’espressione marker della superficie cellulare, poiché i fibroblasti ordinati come FAP+CD90– papillare fibroblasti non acquisire la capacità di sottoporsi ad adipogenesi dopo un periodo più lungo di coltura, mentre i fibroblasti ordinati come FAP+CD90+ o FAP–CD90+ fibroblasti reticolari mantengono la loro capacità di differenziarsi negli adipociti 16 . È importante sottolineare che abbiamo anche riscontrato che i geni papillari e reticolari specifici sono ancora espressi in misura maggiore in FAP+CD90– e CD90+ rispettivamente.

In conclusione, abbiamo stabilito un protocollo per l’isolamento di sottoinsiemi di fibroblasti funzionalmente distinti tramite FACS che per la prima volta permette l’isolamento e l’analisi di popolazioni di fibroblasti puri e ingenui dal derma cutaneo umano. Questo metodo stabilisce un importante progresso per il protocollo di isolamento della coltura di fibroblasti comunemente usato dal derma superiore e inferiore come (i) esiste una pendenza opposta di fibrosi papillare e reticolare dalla superficie cutanea all’ipoderma e (II) i fibroblasti cambiano la loro firma genica in vitro.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo con gratitudine l’assistenza in FACS-sorting di Bärbel Reininger e Wolfgang Bauer. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a B. M. L. dal fondo austriaco per la scienza (FWF: V 525-B28) e dalla Federazione delle società biochimiche europee (FEBS, fondo di ricerca di follow-up). S. F. è destinataria di una borsa di dottorato dell’Accademia austriaca delle scienze (OeAW). Riconosciamo con gratitudine l’eccellente supporto delle strutture principali dell’Università di medicina di Vienna. Ringraziamo Bernhard Gesslbauer, Christine Radtke e Martin Vierhapper per la fornitura di materiale per la pelle umana.

Materials

Material:
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Ammonium chloride Sigma 9718 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium Gibco 17001-074 used for fibroblast growth medium
β-Mercaptoethanol Scharlau ME0095 ! CAUTION
C100 Supplement Thermo Scientific 12556015 used for fibroblast growth medium
Collagenase I Thermo Scientific 17100017 ! CAUTION
Collagenase II Gibco 17101015 ! CAUTION
Collagenase IV Sigma C5138 ! CAUTION
DAPI Thermo Scientific 62248
Dexamethasone Sigma D8893
Dispase II Roche 4942078001 ! CAUTION
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX Gibco 31966-021
EDTA disodium salt Sigma E1644 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10500-064
Hyaluronidase Sigma H4272 ! CAUTION
Insulin Sigma I5500
Isopropanol Merck 1,096,341,011
OilRed O Sigma O-0625
Paraformaldehyd Sigma 158127 ! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070-063
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++ Lonza BE17-512F
Potassium bicarbonate Sigma 237205 used for selfmade ACK Lysis Buffer
PureLink RNA MicroKit Invitrogen 12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR Invitrogen 11752
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix Applied Biosystems 4324018 ! CAUTION Skin and eye irritant.
Troglitazone Sigma T2573
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry Antibodies:
anti human CD31-AF488 Biolegend 303109 Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075
anti human CD45-Pacific blue Biolegend 304029 Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123
anit human CD49f/ITGA6-PE Serotec MCA699PE Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833
anti human CD90/Thy-1-AF700 Biolegend 328120 Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302
anti human CD106-AF421 BD 744309 Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x
anti human CD235ab-Pacific blue Biolegend 306611 Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153
anti-human E-cadherin-PE Biolegend 147304 Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040
anti human FAP-APC R&D FAB3715A Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcX Biolegend 422302 Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
1.4 mL micronic tubes Thermo Scientific 4140
1.5 mL screw cap micro tube Sarstedt 72,692,405
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap Falcon 352235
48-well cell culture cluster Costar 3548
50 mL polypropylene canonical tubes Falcon 352070
70 µm cell strainer nylon Falcon 352350
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome VWR AESCGA670
Aesculap Dermatome blades VWR AESCGB228R
MicroAmp Fast Optical 96well Applied Biosystems 4346906
Primary cell culture dish Corning 353803
Scalpel blades F.S.T 10022-00
Tea strainer x x
Name Company Catalog Number Comments
Fibroblast growth medium:
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S
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Korosec, A., Frech, S., Lichtenberger, B. M. Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (147), e59372, doi:10.3791/59372 (2019).
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