הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית

עור האדם הושג מגברים לבנים ונשים בגילאי 26 עד 61 שנים (עור מוגן בשמש; תיקוני בטן, הפחתת שדיים). בכתב הסכמה המטופל הודיע התקבל לפני איסוף רקמות בהתאם הצהרת הלסינקי, ובאישור של הוועדה הרפואית של וינה רפואי המועצה לסקירה מוסדית. הערה: אנו מספקים פרוטוקול לבידוד של אוכלוסיות שונות מבחינה פונקציונלית הפיצוץ משנה או מ בעובי מלאה (נא להתייחס לסעיף 1) או לאחר לפרק את העור האנושי דרמיס לתוך הרבדים השונים שלה (לדלג על סעיף 1 ולהפנות ישירות לסעיף 2) . 1. הכנת מלוא עובי מניחים 10 ס”מ x 10 ס מ פיסת עור האדם (למשל, מתיקוני הבטן או הפחתת שדיים) עם האפידרמיס הפונה כלפי מטה על נייר סינון עבה. להחזיק את האפידרמיס בחוזקה על הקצוות שלה עם מלקחיים לגרד את שכבת השומן התת עורית עם אזמל. ואז לחתוך את הרקמה לתוך 5 מילימטר מרצועות רחב לפני לשים אותם לתוך צלחת פטרי.הערה: זה מקל על החדירה של Dispase II (המכונה האנזים הנתק מעתה ואילך, ראה סעיף 3) והוא משמש אם האפידרמיס צריך להיות מופרדים מתוך dermis כולו. בסעיף זה דילוג 2 ולהפנות ישירות לסעיף 3. כדי למנוע זיהום, לשמור על הרקמה סטרילי לאחר הסרת כירורגי או לנקות אותו ביסודיות עם אתנול או תמיסת יוד. אם בכלל, טיפול אתנול של פני העור גורם רק מוות תאים מינורי. עבודה תחת תנאים סטריליים. במכסה הזרימה של תרבות הרקמה 2. שכבות של העור האנושי לתוך הלסת והשכבות הרשתית עם דרמטדראום מניחים פיסת עור בגודל 10 ס”מ או 10 ס מ (למשל, מתיקוני בטן או הפחתת שדיים) על נייר מסנן עבה, עם האפידרמיס הפונה כלפי מעלה. להחזיק את העור הדוק על הקצוות שלה עם מלקחיים. פורסים את העור ברקמה חשמלית, מותאמת לעובי חיתוך/עומק של 300 μm, על ידי הזזת הראש של מרחק העור מעצמו, כאשר הלהב נמצא בזווית 90 ביחס למשטח המעטפת. קח את השכבה הראשונה המורכבת של האפידרמיס ואת הלסת הזאת (300 יקרומטר עבה, “שכבת העור 1”, איור 1 ואיור 2) ולשים אותו בצלחת פטרי. המשך מיד לסעיף 3 או הוסף 1x PBS כדי למנוע את הרקמה מייבוש.הערה: כדי למנוע זיהום, לשמור על רקמות סטרילי לאחר הסרת כירורגי או לנקות אותו ביסודיות עם אתנול או תמיסת יוד. עבודה תחת תנאים סטריליים. במכסה הזרימה של תרבות הרקמהזהירות: יש להתמודד בזהירות מרבית מכיוון שהלהבים חדים מאוד. חזור על השלב 2.2 התאמת הדרמטולי לעובי חיתוך של 700 יקרומטר ופורסים את dermis הנותרים. מניחים את הפרוסה העליונה המוגדרת כ/כפי שהשכבה העליונה של השכבה 2, איור 2) לצלחת פטרי נפרדת. המשך מיד לסעיף 4 או הוסף 1x PBS כדי למנוע את הרקמה מייבוש. מגרדים את שכבת השומן התת עורית עם אזמל מן השכבה התחתונה התחתון שיורית הרקמה (> 1000 μm) ולמחוק אותו. לאסוף את הרשתית התחתונה (“שכבת העור 3”, איור 2) בצלחת פטרי אחרת. המשך מיד לסעיף 4 או הוסף 1x PBS כדי למנוע את הרקמה מייבוש.הערה: לחילופין, במקום לגרד את השומן עם אזמל, להסיר את שכבת השומן עם מספריים. זה עשוי לעזור לשים את הדלת הרשתית על הקרח לפני לגרד את השומן משם. 3. הפרדת האפידרמיס והדראמיס הכן 3 U/mL האנזים הנתק (כלומר, Dispase II) פתרון סטרילי 1 x PBS. מניחים את 5 מילימטר פסים העור (מסעיף 1), או האפידרמיס/הלסת הראשונה (משלב 2.2), עם האפידרמיס פונה כלפי מעלה בצלחת פטרי 10 ס”מ עם 10 מ ל 3 U/mL הנתק פתרון האנזים. מודחת את צלחת פטרי ב 37 ° c עבור 1 h. ייתכן שהפרוטוקול הושהה כאן. דגירה האפידרמיס/הלסת מיותרת בתוך פרוטאז במקרר ב 4 ° c במקום. כנדרש לאחסן את השכבות האחרות (שכבת העורי 1, 2 ו-3) לילה שקוע ב-1x PBS בצינורות 50 mL ב 4 ° c.זהירות: עבוד בזהירות עם פרוטאז, זה עלול לגרות את העור והעיניים על מגע. לאחר הדגירה, להעביר את האפידרמיס/הלסת העליונה מכסה את המכסה היבש של צלחת פטרי ולהפריד את האפידרמיס מן דרמיס העליון (שכבת העור 1) עם שני מלקחיים כל אחד מחזיק את הקצה של או את האפידרמיס או דרמיס. 4. העיכול האנזימטי של רקמת העור הגון כל שכבת העורי (שכבת העורי 1, 2 ו-3) בנפרד עם מספריים/אזמל ביסודיות ככל האפשר; ככל שהחלקים קטנים יותר, כך עיכול הרקמה יהיה טוב יותר.הערה: קשיחות של דרמיס יכול להשתנות בהתאם לחלק הגוף הוא מקורו (למשל, הבטן או העור העליון הזרוע). להכין את מיקס העיכול על ידי שילוב 1.25 mg/mL בשנת, 0.5 mg/mL הקולגן השני, 0.5 mg/mL קולגן הרביעי ו0.1 mg/mL hyaluronidase במדיום של הנשר שונה של בינונית (DMPS) עם L-גלוטמין (לראות את הלוח חומרים), 10% סרום העוברי ( FCS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).זהירות: לעבוד בזהירות עם הקולסים כמו אלה עשויים לגרות את העור והעיניים על מגע. לשים כל אחד הרקמות טחון עם 10 מ ל של תערובת העיכול מוכן לתוך צינור 50 mL ו דגירה ב 37 ° c מקלחת מים חמים עבור 1 h תחת עצבנות קבוע. במהלך העיכול להפוך את הצינורות מספר פעמים.הערה: יש לשקול לכוונן את עוצמת העיכול בהתאם לגודל פיסת העור הטחון. אין עומס יתר של 10 מ”ל לערבב העיכול עם רקמות יותר מדי אחרת את התשואה התא יהיה מינימלי. פחות משליש רקמות בתוך הנפח הכולל מומלץ (1:2 w/v). 5. הכנת הבולם היחיד של התא והליזה אריקיטה להפסיק את העיכול רקמות אנזימטיות על ידי הוספת 10 מ”ל בינוני הפיצוץ (DMEM זיכרון עם L-גלוטמין, 10% FCS ו 1% P/S) לרקמות מתעכל. . תעבוד על הקרח מכאן והלאה יוצקים את התוכן של כל צינור באמצעות מסננת תה מנירוסטה רגילה לאסוף ההשעיה התא בצלחת פטרי נקי. לשטוף את מסננת עם בינוני ומחית חתיכות רקמה מתעכל עם קצה של מזרק-בוכנה. לאחר מכן, פיפטה אסף השעיית תא באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר לתוך שפופרת 50 mL. לשטוף את מסננת התא עם בינוני ולאסוף זרימת דרך לתוך הצינור אותו. צינורות צנטריפוגה ב 500 x g ב 4 ° c עבור 10 דקות להסיר ולמחוק supernatant ולשטוף את הגלולה תא עם 5 מ”ל מדיום פיברופיצוץ. חזור על השלב הצנטריפוגה. להסיר ולמחוק את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 1 mL מתוצרת עצמית ACK מאגר הליזה (0.15 M NH4Cl, 10 מ”מ khco3, 0.1 mm Na2edta; pH 7.2 \ u 20127.4). השאר תאים במאגר הליזה למשך כ 1 דקות בטמפרטורת הסביבה (20 \ u201222 ° c). להפסיק את הליזה על ידי הוספת 9 מ ל של 1x PBS עם 10% FCS ו צנטריפוגה את הצינורות שוב ב 500 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.זהירות: זמן הדגירה של הליזה אריתרופויוציה עשוי להיות מותאם אם הפירוק נראה לא שלם (הגלולה האדומה). עם זאת, לא להשאיר את התאים במאגר הליזה אריתרופוזיס למשך זמן רב מדי כדי למנוע הליזה של פיברותקיעות ותאים חיסוניים. 6. חסימת וצביעת פיברוהכדורים עבור FACS להכין 5 μL של פתרון חסימת הקולטן Fc של האדם ב-100 μL של 1x PBS עם 10% FCS ולהשעות את התאים מחדש ב 100 μL של חוסם Fc האדם. . מודקון על קרח במשך 10 דקות עיצוב פאנל מכתים של FACS כדי להכתים את הכדורים בעלי העורי האנושי. מערבבים נגד האדם APC FAP (1:20), אנטי אדם CD90 AF700 (1:30), אנטי אדם E-קדהרין PE (1:20), אנטי אדם CD31 FITC (1:30), אנטי אדם CD45 פסיפיק כחול (1:20), אנטי אדם ITGA6 PE (1:20), אנטי אדם CD235ab פסיפיק כחול (1:1000) ואנטי אדם CD106 פסיפיק כחול (1:100) ב-1x PBS עם 10% FCS. לאחר חסימת קולטן Fc, התאים ספין למטה ב 500 x g ב 4 ° c עבור 3 דקות להסיר ולמחוק את התאים הללו ולהשעות מחדש ב 100 μl של ערבוב נוגדן. מודקון תאים בחושך ב 4 ° c עבור 20 דקות. לפני כתמים, להסיר 20 μL של מדגם עם מספר תאים גבוה עבור בלתי מוכתם ובודד FACS שולטת כתם. שטוף את התאים המוכתמים ו-FACS שולטת פעמיים עם 500 μL 1x PBS עם 10% FCS ו צנטריפוגה ב 500 x g ב 4 ° c עבור 3 דקות. בינתיים, להוסיף 4 ′, 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) ל-1x PBS עם 10% FCS לבצע ריכוז סופי של 1 μg/mL. להסיר ולמחוק supernatant, להשעות מחדש את התאים בפתרון μl dapi 200 ולסנן כל השעיית תא דרך מסננת תא 70 יקרומטר לתוך צינור של 5 mL facs.הערה: אם FACS הולך להתבצע עם עיכוב, להוסיף DAPI ולסנן זמן קצר לפני ההקלטה. 7. לאחר האסטרטגיה האנושית לבידוד בידוד ומערכת התקנים הקלט את הפקדים של זרימת הרשומות, לקבוע הגדרות מתח נכונות ולבצע את הפיצוי המתאים. שער לתאים בודדים וחיים (DAPI-), פסיפיק כחול, PE ו-fitc תאים שליליים (CD45-, CD31-, CD235ab-, CD106-, ITGA6- ו-E-קדהרין-) כדי לקבל שלוש אוכלוסיות הפיצוץ: fap+ CD90-, fap+CD90+ ו fap-CD90+ תאים. ראה איור 3. מיין שלוש אוכלוסיות הפיצוץ משנה לתוך הנפרד 1.5 mL בורג כובע מיקרוצנטריפוגה צינורות מילא או עם 350 μL מאגר הליזה לבידוד RNA או מלא עם 350 μL הצמיחה פיברוהפיצוץ בינונית (לראות את הטבלה של חומרים) עבור תרבות התא. היפוך צינורות מיד לאחר מיון או לשים צינורות מאגר הליזה לתוך חנקן נוזלי לקפוא או לשים שפופרות בינוניות על הקרח.זהירות: הכן מאגר לפירוק עם 0.1% b-Mercaptoethanol בתוך מכסה המנוע ולהימנע משאיפת. 8. שיטת פיברותקיעות ואדיפוגנזה לאחר FACS, התאים ספין למטה ב 500 x g עבור 3 דקות ב 4 ° צ’ ולוחית שוויון מספרי תאים (5000 \ u201210, 000 תאים/ובכן) ב הצמיחה פיברופיצוץ בינונית (לראות את הטבלה של חומרים) ב 48-ובכן מנות תרבות התא. להשאיר את התאים לגדול עד שהם מגיעים 70% השטף. להוסיף 5 μg/mL אינסולין, 5 μM troglitazone, 0.5 mM 3-isobutyl וטיל-1-מתילקסאתה (IBMX) ו-1 μM dexametone כדי הצמיחה פיברוהפיצוץ בינוני כדי להכין בידול מדיום. החלף את המדיום של תאים מתורבתים עם בידול בינוני ולתת תאים להבדיל 14 ימים. החלפת מדיום אחרי יום 2 עם מופחת adipogenesis בינונית המכיל 5 μg/mL אינסולין ו 5 μM troglitazone. . לחדש את המדיום כל 3 או 4 יום תקן את התאים עם 4% בכיוון הכל1 עבור 20 דקות בטמפרטורת הסביבה (20 \ u201222 ° c) בבידול יום 14. רוחצים את הבארות עם 60% איזופנול ומאפשרים לו להתאדות לחלוטין. כתם תאים עם 5 מ”מ שמן אדום O (מסנן לפני השימוש) עבור 20 דקות. שטוף תאים מוכתמים ארבע פעמים עם מים מזוקקים. . המשך לבצע מיקרוסקופזהירות: היחידה לה, רעילה ומזיקה. . טפל בזהירותהערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. תאים קבועים ניתן לאחסן ב-1x PBS ב 4 ° צ’ עד כתמים שמן אדום O מבוצע. כיסוי הצלחת עם הסרט פרפין לפני האחסון כדי למנוע אידוי. תאים תמונה שקועים במים עם מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 10x עם אור משודר.