JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Новый протокол для генерации физиологических иммуногенных дендритных клеток

Published: May 17, 2019
doi:
10.3791/59370
, , , , , , , , , , ,
1Department of Dermatology,Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department,University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology,Yale University School of Medicine

Summary

Было разработано устройство или плита трансиммунизации (TI) и соответствующие протоколы для воспроизведения ключевых особенностей экстракорпоральной фотохимиотерапии (ИКК) в экспериментальной обстановке, позволяющей производство физиологически активированных, настраиваемые дендритные клеток (Вмрс) для иммунотерапии рака.

Abstract

Экстракорпоральная фотохимиотерапия (ИКР) является широко используемой иммунотерапии рака для кожного т-клеточной лимфомы (цккт), оперативника в более чем 350 университетских центрах по всему миру. В то время как клиническая эффективность ИКК и образцовый профиль безопасности привели к ее широкому применению, разъяснения основных механизмов остаются проблемой, отчасти из-за отсутствия лабораторной модели ИКК. Чтобы преодолеть это препятствие и создать простую, дружественную пользователю платформу для исследования ИКК, мы разработали уменьшенную версию клинического устройства для обработки лейкоцитов, пригодного для работы как с моделями мышей, так и с небольшими образцами крови человека. Данное устройство называется Камера Трансиммунизации (TI) или пластина. В серии знаковых экспериментов, миниатюрное устройство было использовано для производства клеточной вакцины, которая регулярно инициировала терапевтическое противораковое иммунитет в нескольких сингенетических моделях опухоли мыши. Удалив индивидуальные факторы из экспериментальной системы и выяснив их вклад в антиопухолевую реакцию в естественных условиях, мы затем выясняли ключевые механистические факторы, направленные на ВАКЦИНАЦИЮ от ИКК. В совокупности наши результаты показали, что анти-опухолевые эффекты ИКЭ инициируются дендритными клетками (DC), физиологически генерируемые при взаимодействии крови моноцитов с тромбоцитами в пластине TI, и загружаются с антигенами из опухолевых клеток, Апоптотические клетки которых смерть тонко титруют воздействием фотоактизационная ДНК кросс-связывающий агент 8-метоксипарален и УФ-лучей (8-швабра). Когда вернулся в мышь, эта клеточная вакцина приводит к конкретным и передаче анти-опухоли т-клеточный иммунитет. Мы подтвердили, что камера TI также подходит для обработки крови человека, производя человека DC полностью сопоставимым в состоянии активации и профиле к тем, которые получены из клинической камеры ИКК. Представленные здесь протоколы предназначены для исследований ИКК в мышах и человеке, контролируемых генераций апоптотических опухолевых клеток с 8-ШВАБРОЙ, а быстрое производство физиологических человеческих и мышиных моноцитов-производных РС для различных применений.

Introduction

Экстракорпоральная фотохимиотерапия (ИКК) является установленной иммунотерапией, которая широко распространена в университетских центрах по всему миру. Его использование было обусловлено уникальной селективностью, безопасностью и двунаправленной эффективностью терапии ИКБ, черт, которые разделяет ИКБ с самой физиологической иммунной системой, с которой она, как представляется, партнера. ИКК избирательно Иммунизирующая против злокачественных клеток в кожной лимфоме т-клеток (кткл)1,2и селективно толеризации для целевых антигенов в трансплантации, аутоиммунитет, и трансплантата против хозяина болезни (РТГ) настройки 3-х , 4. иммуногенность икр подсвечиваются ее зависимостью от НЕПОВРЕЖДЕННЫМ CD8 т-клеточного отсека в КЦКТ5, в то время как специфичность отражается в очень благоприятной неблагоприятной реакции профиля ИКК, без целевого подавления иммунитета при пересадке или Настройки Ртбг, а также отсутствие повышенной оппортунистической инфекции восприимчивость в кткл, где непатогенные т-клеточные клоны потенциально могут быть потеряны вместе с злокачественными т-клетками.

Учитывая клиническую значимость ИКК, надежда на то, что лучшее понимание ее механизмов может расширить терапевтическое воздействие ИКК на более широкий спектр раковых заболеваний и иммунологических расстройств, стимулировала международный интерес. Два практикума национально санкционированных, Национальный институт здоровья (НИЗ) государство-оф-науки симпозиум6 и Американское общество для апгереза консенсусной конференции7, были проведены и сообщил, с целью ускорения идентификации основных клеточных вкладчиков в борьбе с раком и толероженик последствиям ИКК.

На сегодняшний день, несмотря на многочисленные опубликованные доклады, в которых предпринимается попытка рассмотреть механизм ИКК, два основных препятствия препятствуют научным достижениям. Во-первых, исследование механизмов ИКК в экспериментальной лаборатории ограничено отсутствием миниатюрного устройства ИКК, которое в полной мере отражает клеточные и в естественных условиях последствия ИКК и применимо к моделям животных. Во-вторых, глубокий лабораторный анализ образцов ИКК в клинических условиях был ограничен ограниченным наличием иммунных клеток, обработанных ИКК, которые требуют доступа к лечебным центрам, и дополнительно подвержены срокам инфузии пациента, а этическая потребность в бескомпромиссных комплектах лейкоцитов, Перезаряженные пациентами.

Для устранения препятствий, мешающих прогрессу исследований ИКК, мы поставили перед собой вопрос о разработке миниатюрного аппарата ИКК, который бы наиболее тесно имитирующий ключевые элементы терапии. Стандартное лечение ИКК включает в себя прохождение лейкоцитов-обогащенных лейкоцитами пациента через 1 мм толщиной, ультрафиолетовое излучение (Уфа)-прозрачная, пластиковая пластина6,8. В пластине, лейкоциты подвергаются 8-метоксисорален (8-ШВАБРА), Фото-актинационной агента, который после Уфа экспозиции переходно преобразуется в реактивную форму (8-ШВАБРА), способный ДНК кросс-ссылок через его двувалентные привязки к пирмидина баз на нити ДНК сестры9,10. Обработано, 8-ССобработанных лейкоцитов собираются и возвращаются внутривенно пациенту.

Поскольку ИКБ сама по себе является двунаправленной терапией, иммунизированием при раке и толеризации в трансплантации, аутоиммунных и Ртбг, для уточнения мы назвали режим иммунизации модели ИКЧП “трансиммунизации” и режим толероженик “транстоляризация”. В первую очередь мы сосредоточились на трансимунизации модальности. Наш недавно сообщили миниатюрных масштабируемых мышь к человеку устройство ИКК, трансиммунизации (TI) камеры или пластины, и соответствующий протокол, воспроизводить как сотовые и в естественных условиях эффекты человеческого устройства ИКК в рак установление11.

Для того, чтобы трансиммунизации в естественных условиях модели, как клинически актуальным, как это возможно, мы приступили к иммунотерапии после подкожно вводили сингенетических опухолей мыши стал ощутимым, тем самым проверяя эффективность протокола в установленных рака. Как и в ИКК в КТКЛ, в доказательстве принципа трансиммунизации в модели ЮММ 1.7 меланомы используются мононуклеарные клетки периферической крови (УАТС) из опухолевых животных. Клетки передаются через пластину TI в потоке. Пока 8-ШВАБРА обработка клеток в миниатюрной камере по возможности, предпочтительно дирижировать ее отдельно, для того чтобы обеспечить что только пожеланного типа клетки подвергается действию до 8-ШВАБРАA. Более ранние исследования показывают, что толероженик влияние ИКК опосредовано 8-швабрыA-ранены антиген-представляя клетки12, в то время как иммуизирующий эффект требует 8-швабры травмы целевых опухолевых клеток11. В протоколе трансиммунизации либо опухолевые клетки, либо иммунные клетки, могут выборочно подвергаться воздействию 8-ССA по мере необходимости. В виду того что максимальное время контакта между 8-шваброй-поврежденных опухолевыми клетками и НАВЕДЕННЫЕ к ИКЭ-дендритные клетки (DC) было показано, что значительно увеличивает иммунотерапевтический потенциал клинической икр13, мы включили ночную шаг совместного инкубации в наш протокол. После ночной инкубации, обработанные клетки возвращаются к опухоли подшипника животного.

Эта система надежно сократила рост опухоли и инициировала специфическую противоопухолевую иммунную систему у мышей с установленными синогенным опухолями11, и позволила вскрыть механизм клинического противоопухолевого применения ИКК. В нескольких исследованиях мы показали, что ИКК иммунитет инициирован через ex естественных условиях активации тромбоцитов в Ti пластины14,15. Активированные тромбоциты впоследствии сигнализируют о созревании моноцитов-дендритных клеток14, что приводит к выработке физиологических вмрс. Новообразованные моноцитов, полученных РС способны кросс-настоящее интернализированных антигенов из 8-ССповрежденных опухолевых клеток для активации антиген-специфические т-клеток ответы16. Как было предложено ранее12,17, однако, 8-СС-индуцированной повреждение зарождающихся РС сами могут противодействовать или даже повернуть вспять антиопухолевого эффекта11, обеспечивая механистический связь с терпимостью к ИКК.

Пластина TI также использовалась для производства физиологически активированных РС от человека. Аналогично изучению мыши, человеческие TI-производные РС зависят от пластичного прохода в присутствии тромбоцитов для их поколения, как правило, идентичны этим производным в клинической пластине ИКК, и способны эффективно обрабатывать и перекрестные представления человеческих опухолевых антигенов для активации человеческих т-клеток11,16.

Раскрыв механизм иммунотерапии ИКК, мы раскрыли метод для быстрой генерации физиологической мыши и дендритных клеток, обладающих желаемой специфичностью антигена, которые могут быть функционально модулированы. Инновационное устройство и протокол TI имеют существенное потенциальное значение в области исследований и терапии ИКК и лечения рака в более широком смысле, и в любой другой области с интересом к физиологическим, функциональным дендритными ячейкам либо в иммунизации, либо толеризации модальности. Мы надеемся, что эта публикация предоставит необходимые инструменты для тех, кто заинтересован в таких областях исследований.

Protocol

Все методы мыши, описанные здесь, были одобрены институциональным Комитетом по уходу и использованию животных Йельского университета в соответствии с рекомендациями национальных институтов по здравоохранению животных. Все человеческие исследования проводились с кровью, пожертвовано здоровыми добровольцами, с письменного информированного согласия. Исследования крови человека проводились в соответствии с признанными этическими принципами (например, Хельсинкская декларация, CIОМС, доклад Бельмонт, общее правило США) и были одобрены Йельским исследуемого Наблюдательного Совета по протоколу No 0301023636. Примечание: Ниже приводится протокол, описывающий трансиммунизацию для анти-опухолевой терапии синдромических опухолей мыши. 1. синогенный ЮММ 1.7 имплантация опухоли Следуйте установленным протоколам, чтобы имплантировать сингенетические опухоли в фланги мышей по мере необходимости к линии опухоли клеток, представляющих интерес.Примечание: Протокол ниже описывает ЮММ 1.7 C57BL/6 модель опухоли меланомы мыши. ЮММ 1.7 меланома клетки были любезно предоставлены доктором Босенберг, Йельский18. Оттепель замороженных Алиготе клеток и использовать клетки после одного прохода клетки. Культура свежезаваренным-Размороженный ЮММ 1.7 клеток в питательной смеси в Дульбекко в питательную смесь F-12 среды (ДМЭМ/F12), дополнена 10% тепло-инактивированной фетальной сыворотки (ФПС), 1% пенициллин/стрептомицин, и 1% ненезаменимых аминокислот, в соответствии со стандартными условия культуры ткани (37 °C, 5% CO2). Сбор ЮММ 1.7 клетки на 60 \ u201270% слияния, добавив достаточно трипсина-ЭДТА для покрытия нижней части пластины культуры клеток или колбы (например, 4 мл для T75 колбу). Отдых клеток культуры сосудов при комнатной температуре в течение 3 \ u20124 мин, мягко постукивая по дну или по бокам судна иногда, чтобы помочь отделить клетки. Добавить 1 мл фетальной сыворотки (ФПС) на 4 мл трипсина-этилендиаминетической кислоты (ЭДТА), чтобы остановить реакцию, как только большинство клеток отделяться. Соберите клетки по пипетки в 15 мл конической трубки. Промыть колбу с фосфат-буферизованные физиологический раствор (PBS) и добавить промыть в той же трубки сбора. Заполните трубку до 15 мл с PBS. Примите вне малое Алиготе и подсчитывайте клетки. Спин вниз в течение 10 минут на 250 x g в стандартной культуре ткани центрифуги для сбора опухолевых клеток. Ресуспензируем ЮММ 1.7 клетки в PBS при плотности 1 х 106 клеток/мл. Впрыснуть 1 x 105 юмм 1.7 опухолевых клеток подкожно в 100 мкл PBS в правой флангах получателя от 4 до 6-недельного дикого типа мужчины C57Bl/6J мышей, обезболивают в соответствии с институциональными руководящими принципами (например, 3 \ u20125% изофлуран ингаляционный газ, анестезия подтверждается отсутствием задних лапы щепотку рефлекс). Монитор объем опухоли с помощью двух еженедельных измерений перпендикулярных диаметров опухоли и высота с помощью сукалина. Рассчитать ЮММ 1.7 (объем опухоли как длина опухоли x ширина х высота)/2. Инициировать трансиммунизации терапии, когда опухоли стали просто ощутимым; для ЮММ 1.7 опухоли, это, как правило, день 7 \ u201210 после имплантации опухоли. 2. собрание мононуклеарных клеток периферической крови для Трансиммунизации Соберите 100 \ u2012150 мкл крови от каждой опухолевой несущей мыши через щеку кровоточить. Как кровь собирается, бассейн крови от каждой группы лечения мыши (каждый 5 экспериментальных мышей + 5 контрольных мышей) в одной 15 мл трубки, содержащей 5 000 U/mL гепарин. Используйте 10 мкл 10% гепарин на 100 мкл крови собраны.Примечание: Смешайте трубку часто во время сбора, чтобы избежать свертывания крови. Хотя контроль опухоли несущих мышей может быть кровь в то же время, как экспериментальные мышей, для обеспечения равных условиях с группой лечения, “контроль” кровь может быть либо отбрасываются, или в сочетании с кровью группы лечения, чтобы обеспечить дополнительные экспериментальной АТС для группы лечения по усмотрению следователей. Настройка 1 15 mL трубки с 4 мл лимфоцитов изоляции среды (см. таблицу материалов) на 5 \ u201210 мышей кровь. Медленно слоя крови (собранные с опухолевой подшипник мышей) на верхней части среды. Вращайте клетки в течение 20 минут при температуре 1000 \ u20121, 500 x g , чтобы отделить АТС от красных кровяных телец. В конце центрифугирования, собирать верхний слой плазмы, оставляя ~ 0,5 mL оставшиеся выше Баффи пальто, и хранить при температуре 4 °C для последующего использования (шаг 7,1). Соберите слой охристые пальто в чистую 15 мл трубки, заполните с PBS до 15 мл, и спина в течение 10 минут на 250 x g в стандартной культуре ткани центрифуги для сбора КПМС. Осторожно пипетки от supernatant, и ресуспензируем гранулы, стряхивая трубку. Не Декант, так как гранулы мягкие и могут быть потеряны. Добавьте 2 мл в буфере лизиса красных кровяных телец (см. таблицу материалов) в трубку, чтобы удалить оставшиеся красные кровяные клетки от КПМК. Инкубировать на льду в течение 10 мин. Заполните трубку с PBS до 15 мл, и спина вниз в течение 10 минут на 250 x g в стандартной культуре ткани центрифуги для сбора скпмс. Осторожно пипетки от supernatant, и ресуспензируем гранулы, щелкая. Не Декант, так как гранулы мягкие и могут быть потеряны.Примечание: На этом шаге очищенная АТС может быть модифицирована, как лучше всего подходит для эксперимента. Различные компоненты АТС (тромбоциты, моноциты, другие типы иммунных клеток) могут быть истощены или изолированы от УАТС по мере необходимости. Кроме того, сами АТС могут подвергаться воздействию 8-швабрыA, либо до, либо после раздела 4 (до или после прохождения пластины-после раздела 2 или до раздела 5), следуя протокольным шагам 3,3 \ u 20123.8 и заменяя КПВ для юмм 1,7 ячейки. Это будет топонимы иммуногенную способность лечения, а вместо этого способствовать иммунной толерантности. Для каждой группы лечения (каждая 5 экспериментальных мышей + 5 контрольных мышей), ресуспензируем гранулами в 300 мкл ФПС. 3.8-ШВАБРА/УВА лечение опухолевых клеток Культура и собирать ЮММ 1.7 опухолевых клеток, как описано в шагах 1,2-1.3 для подготовки 8-швабрыA-подвергается антиген опухоли клеток источник. Подготовьте 2,5 x 106 юмм 1.7 опухолевые клетки на лечение группы из 5 мышей. Для каждой группы лечения, ресуспензируем гранулы опухолевых клеток в ФПС на 2,5 х 106 клеток/300 мкл (~ 8,33 x 106 клеток/мл). С тканью культуры капот выключил, добавить 8-швабры (см. таблицу материалов) для юмм 1.7 клеток опухоли суспензии для окончательного 8-сс концентрация 100 нг/мл.Внимание: 8-швабра-это ФОТОАКТИДОНЫЙ ДНК-повреждающее вещество и канцероген. Соблюдайте осторожность при обработке и дозирования, Избегайте контакта с обнажной кожей и выбросьте соответствующим образом. Смешайте клетки хорошо, оберните контейнер клетки в фольге олова, и инкубировать в течение 20 минут при температуре 37 °C. Предварительно пальто 12-хорошо ткань культуры пластины, заполнив один хорошо для каждой группы лечения 5 мышей (2,5 х 106 юмм 1.7 опухолевых клеток) с 1 мл ФПС, и холодильник заполнены пластины для 20 мин при 4 °C. Включите источник УФ-света для предварительного прогрева.Осторожно: УФ-свет является канцероген. При работе с источниками света Уфа работают быстро и осторожно, защищают кожу от воздействия и используют щиты лица или защитные очки для защиты лица и глаз. После 20 мин, переместите охлажденный 12-хорошо пластины (шаг 3,5) к тканевой культуры капот, удалить ФПС из скважин, и добавить 300 мкл (2,5 х 106 клеток/хорошо) СС-подвергается опухолевые клетки (от шага 3,4) в хорошо. Подвергать клетку-содержащую пластинку предварительно нагретому источнику света УФ-излучения для полного облучения 4 J/cm2.Примечание: Концентрация 8-швабры и УФ-Уфа, описанная здесь, откалиброваны для линии опухолевых клеток ЮММ 1.7. Титрования 8-швабры/УВА дозы, достаточно, чтобы вызвать 100% опухолевых клеток смерти в течение 1 недели воздействия, должны быть выполнены для каждой линии экспериментальной опухоли клеток, для того, чтобы определить эффективную дозу убийства. Это критически важно для мыши в естественных условиях TI эксперименты, потому что клетки вводят ретро-орбитально (шаг 6,1) и, таким образом, любой неповрежденной опухолевые клетки могут иным образом формы опухоли глаз в обработанных животных. В качестве ориентира, 4 \ u20128 J/cm2 из Уфа, 100 \ u2012200 нг/мл 8-СС, является типичным эффективным диапазоном для большинства линий опухолевых клеток. Соберите 8-ССобработанных опухолевых клеток от каждого хорошо, закрученного пластины и петтинг тщательно, чтобы обеспечить полное восстановление клеток. 4. TI пластины прохождение клеток Для каждой группы лечения 5 мышей, объединить в один 1,5 mL конической трубки 300 мкл соответствующего УАТС (от шага 2,11) и 300 мкл 8-СС обработанных опухолевыхклеток (от шага 3,9). Смешайте клетки. Используйте шприц 10 мл для заполнения «входных» и «выездных» наборов труб TI (см.Таблица материалов) с ФПС. Откройте тюбинговые зажимы, чтобы заполнить трубы, и закройте зажимы после того, как трубы заполнены до отключения шприца, чтобы сохранить ФПС внутри трубки. Используйте пипетку P1000, чтобы добавить КТМС и смесь опухолевых клеток (от шага 4,1) к пластине TI (см. таблицу материалов). Держите тарелку под углом 45° , поместите наконечник пипетки надежно в потребление пластины Ti, и заполните пластинку медленно, избегая пузырьков. Удалить пипетки отзыв от приема перед выпуском пипетки поршень. Пластина вмещает 450 мкл; вернуть оставшиеся клетки в 1,5 mL конической трубки. Инкубировать ФПС заполненные трубки, заполненные ячейкой TI пластины, и 1,5 mL коническая трубка, содержащая оставшиеся клетки в инкубаторе культуры ткани на 37 °C для 1 h. После инкубации, опорожнить трубы TI гравитацией, выпуская зажимы. Используйте пипетку P1000, чтобы удалить ячейки из пластины TI, вставив кончик пипетки с поршнем, подавленным в порт пластины. Держите тарелку под углом 45° и заполните наконечник пипетки P1000. Поместите клетки обратно в свои оригинальные 1,5 mL конической трубки. Для запуска пластины TI, подключите выход трубки к пластине и закрепите пластины TI в системе работает пластины. С помощью шприца 1 мл, составить 600 МКН и смесь опухолевых клеток из 1,5 mL конической трубки, избавиться от любых пузырьков в шприц, прикрепить шприц к входной трубе с зажимом открытым и медленно заполнить до тех пор, пока жидкость достигнет конца трубки. Прикрепите свободный конец входной трубки к пластине TI и продолжайте аккуратно загружать оставшийся объем. Закройте входной зажим. Отсоедините 1 мл шприца и соедините входную трубку с насосом шприца. Закрепите трубки выхода на чистую 1,5 mL коническую трубку для сбора клеток. Отрегулируйте скорость потока шприца насоса до 0,09 мл/мин, но не начинайте насос еще. Наклоните пластину TI ~ 30° к стороне насоса шприца, используя платформу Ti, запущную или любые другие средства (например, небольшой плоский объект под одним концом пластины). Аккуратно отпустите зажим на входном трубке. Запустите шприц насос, наблюдая тщательно, как заполняет пластины TI, и Флик трубки или пластины по мере необходимости должны любые воздушные пузыри препятствовать потоку. Как только пластина TI полностью заполнена, наклоните ее ~ 30° в противоположном направлении, поскольку она впадает. Когда все клетки и жидкости в 1,5 mL конической коллекции трубки, остановить насос. Чтобы вымыть пластины TI, отключите входную трубку от шприца насоса, подключиться к 1 мл шприца заполнены 600 мкл ФПС, и следуйте процедуре для шагов 4,8 \ u 20124.9. Отрегулируйте скорость потока шприца насоса 0,49 мл/мин, отпустите входной зажим, и запустить TI пластины, как описано в шагах 4.12 \ u 20124.13, собирая мыть в том же 1,5 mL конической трубки. Флик или нажмите на пластины TI мягко все время, чтобы помочь в отсоединении и ускользает от любых адепт клеток. Спин коллекции 1,5 mL конической трубки в бенстоп в микрофуге 250 x g для 8 мин. отбросить supernatant. 5. Подготовка аутологичной сыворотки мыши для ночного культурного среднего Соберите кровь из 10 \ u201212 недели старых мышей C57BL/6J любым институционально утвержденным методом (например, кровотечение из глаз, кровотечение из Вены, щеки кровоточить, или терминал кровоточить от сердечного прокола), без каких-либо антикоагулянтов. Оценка сбора 1 мл крови для каждого 300 мкл сыворотки необходимо.Примечание: Нужно было бы 300 мкл сыворотки для каждой группы лечения 5 мышей в эксперименте. Разрешить кровь сгустка ночь на 4 ° c. Спин вниз свернувшейся крови на 3 000 x g в течение 15 мин. тщательно собирать верхний сыворотки, содержащий слойПримечание: Сыворотка может быть использована немедленно, чтобы сделать ночной инкубации клеток среды (шаг 6,1), или сохраняются для будущих экспериментов. Для сохранения сыворотки замерзают в аликвоте при температуре-20 °C. 6. Ночная Соинкубация АТС с антигеном Ресуспензируем и гранулы опухолевых клеток (шаг 4,5) в 2 мл четкого RPMI с 15% аутологичной сыворотки мыши (подготовлен в шаге 5). Плита в 35 мм, не ткань-культуры обрабатывают стерильные блюда, и инкубировать ночь в стандартных условиях культуры ткани (37 ° c, 5% CO2).Примечание: Если УАТС используются при неклеточном антигене (пептид, нанопротеины, белок и т. д.), опустить секцию 3 протокола и перейти из раздела 2 непосредственно в раздел 4, добавив желаемый антиген к пластине TI, который был принят КПДК для ночного совместного инкубации здесь, в Шаг 6,1. На следующий день, тщательно отделить любые адепт клетки из нижней части блюда скребок культуры ткани, вращая блюдо в то время как выскабливание, чтобы обеспечить даже ячейки сбора. Соберите ячейки в трубке 15 мл. Добавьте 2 мл PBS в блюдо и повторите выскабливание шаг, собирая клетки в той же трубе. Промыть 35 mm блюдо с 1 мл PBS и добавить промыть в той же трубе. Спина в течение 10 минут на 250 x g в стандартной культуре ткани центрифуги для сбора клеток. Осторожно пипетки от супернатант и ресуспензируем гранулы, стряхивая трубку. Не Декант, так как гранулы мягкие и могут быть потеряны. 7. Re-впрыска TI-обработанных клеток в тумор-подшипник мыши Спин вниз аутологичной плазмы (подготовленный в шаге 2,4) при 750 x g в течение 15 мин до осадка любых частиц. Ресуспензируем ячейки гранулы (от шага 6,4) в 600 мкл аутологичной плазмы или PBS. Впрыснуть клетки на 100 мкл на мышь в ретро-орбитальное сплетение надлежащим обезболивающим (например, 3 \ u20125% неингаляторный газ, анестезия подтверждается отсутствием задних лап щепотку рефлекса) опухолевые экспериментальные мыши. Если это желательно, повторно придать контроль опухоли подшипник мышей с 100 МКН аутологичной плазмы в одиночку, или PBS. Для ЮММ 1.7 опухолевые мышей, повторите лечение (ступени 2-7,2) два раза в неделю в течение 3 недель, в общей сложности 6 процедур. Сбор и обработку КПС от опухолевых мышей еженедельно (протокол разделы 2 \ u20124) по понедельникам и четвергам, и вновь влить после ночного инкубации (протокол разделы 5 \ u20127) по вторникам и пятницам.Примечание: Эта схема лечения была разработана для специфической кинетики роста ЮММ 1.7 опухолей у мышей. Это может потребоваться быть титруют для других опухолевых систем с более медленными или более быстрыми темпами роста опухоли-соответственно увеличение или уменьшение количества процедур. Монитор объем опухоли через два раза в неделю измерения-предпочтительно во время терапии администрации (вторник и пятница)-из перпендикулярных диаметров опухоли и высота с помощью сукалина. Завершение эксперимента, когда контроль объемов опухоли достигнет максимального размера, разрешенной институциональными руководящими принципами и протоколами. 8. Протокол адаптация для лечения Смалых томов человеческой крови Адаптируйте протокол для использования с человеческими клетками, сначала изолируя КПВ от человеческой крови. Используйте гепарин как анти-коагулянт, с любым предпочтительным протоколом изоляции АТС. Убедитесь, что изолированные фракции АТС содержит физиологическое количество тромбоцитов, для лучших результатов протокола. Монитор тромбоцитов предварительно и после-АТБМК изоляции с помощью любого стандартного гематологического счетчика. При использовании человеческого клеточного антигена источника, лечить человека антигенных клеток после шагов, описанных в разделе 3 для ЮММ 1.7 клеток. Титруйте 8-швабры и УФ дозы соответственно. Выполните шаги по пластине, описанные в разделе 4, с использованием до 3 х 107 АТС per Ti пластины. Культура АТС ночь с сотовой/другой антиген выбора, как описано в разделе 6, но заменить 15% человека AB сыворотки для аутологичной плазмы мыши для ночного среды в шаге 6,1. Используйте полученные клетки в любом желаемом пробирках. На пример, Co-культура с антиген-реактивные т-клетки наблюдать антиген-специфически реакции T-клетки начатые TI-обработкой клетками.

Representative Results

Недавно мы разработали масштабируемое миниатюрное устройство ИКК от мыши до человека, пластину TI (рис. 1A) и разработали соответствующие протоколы лечения. Прибор и протокол воспроизводят ключевые клеточные и в естественных условиях иммунизацию ИКК, именуемой «трансиммунизацией». Доказательство-оф-принцип мышиных трансиммунизации протокол11 (рис. 1b) состоит из экстракорпорального Ti прохождение пластины из периферических кровяных мононуклеарных клеток (КПИ) от опухоли несущих мышей вместе с апоптотической8-СС-подвергается опухолевые клетки. Примечательно, что камера TI прозрачна и размерна в соответствии со стандартной формой слайда микроскопии, что позволяет легко визуализировать взаимодействие клеток внутри пластины TI в любой точке протокола (видео 1). TI-пластины активированных иммунных клеток инкубировали ночь с 8-СС-подвергается апоптотических опухолевых клеток, способствуя поглощение опухолевых клеток, обработка, и передачи опухолевых антигенов в РС. На следующий день, смесь инкубируемых клеток возвращается в кровоток опухоли подшипника животного. Контролируйте животных проходят идентичные процедуры сбора крови, чтобы нормализовать для любого влияния лимфистощение на рост опухоли, но вместо этого получить PBS повторной инфузии. Рост опухоли у всех животных контролируется на протяжении всего эксперимента. В исследованиях, использующих юмм 1.7 синогенную модель меланомы мышиных18, протокол трансиммунизации повторяется два раза в неделю в течение трех недель, в общей сложности шесть процедур в каждом животном (рис. 1b). Терапия появилась хорошо переносится во всех животных, получавших (> 100), и последовательно показали снижение ЮММ 1.7 рост опухоли в лечении против контроля животных, как это наблюдалось в 9 независимых экспериментов, проведенных в течение 2 лет (рис. 2A, B). Результаты показывают кумулятивные данные роста опухоли в трансиммунизации обработанных и контрольных животных над всеми экспериментами (рисунок 2A), а также репрезентативные кривые роста опухоли для отдельных животных в рамках одного эксперимента, чтобы обеспечить чувство изменчивости в системе (Рисунок 2B). Мы обнаружили, что успех Протокола в решающей степени зависит от наличия моноцитов в обработанных УАТС, наличия тромбоцитов в фракции АТС и шага TI. Когда проход пластины опущен, или когда либо тромбоциты, либо моноциты истощаются из фракции АТС, то терапевтический эффект больше не наблюдается (Рисунок 3A). Лечение также требует наличия апоптотических опухолевых клеток. Это неэффективно в отсутствие либо иммунных клеток или антигена источника, или в присутствии несоответствие антигена, например, когда мышей с ЮММ 1.7 опухоли лечатся с помощью MC38 клетки карциномы толстой кишки (рис.3B). Для иммунизации результат также имеет решающее значение, чтобы избежать воздействия КПВ 8-ШВАБРА. 8-МСС-облученныхУППне только отменить, или, возможно, даже обратное, анти-опухолевого иммунитета (рис. 3c), но и препятствовать иммунизации потенциал неэкспонирования клеток, как и в эксперименте, где равное количество 8-швабры а-подвергаются и 8-СС Защищенное АТС было использовано без заметного противоопухолевого эффекта (рис.3c). С помощью АТС человека Камера TI и протокол трансиммунизации приводят к успешной активации моноцитов в DC, неотличимы от клеточной поверхности и внутриклеточных маркеров активации, которые достигаются за счет клинической пластины ИКК (Таблица 1). Как и в мыши исследования, DC активации (рис. 4) и способность трансиммунизации генерируемые РС для обработки и настоящего антигена (рис. 4A,C) критически зависят от наличия тромбоцитов в АТС, и на прохождение пластины Ti. Трансиммунизации-активированный человеческий РС может эффективно обрабатывать и кросс-настоящее либо пептидные антигены (рис. 4B), или антигены изцелых 8-СС-подвергается человека опухолевых клеток, чтобы активировать человека антиген-специфические т-клеточных линий в пробирке (Рисунок 4C), в Ti и в зависимости от тромбоцитов (Рисунок 4c, C). Рисунок 1: схема Трансиммунизации (TI) и схемы протокола. A) диаграмма и спецификации камеры обработки трансиммунизации (пластины TI). (B) схематическое описание обработки трансиммунизации экспериментального документооборота. Кратко, Животные привиты подкожно (SC) с синогенной опухолевой клетки; животные с ощутимыми опухолями лечатся два раза в неделю по крови вничью, изолированность АТС из крови, прохождение УАТС через аутологичную пластинку с покрытием с тромбоцитами в присутствии 8-швабры/Уфа обработанных опухолевых клеток, УПП и соинкубации опухолевых клеток в одночасье, и повторная инъекция клеток внутривенно в те же опухоли несущих животных. Объем опухоли измеряется на протяжении всего эксперимента. Эта цифра была изменена с11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Рисунок 2: Трансиммунизация контролирует рост ЮММ 1.7 генетических опухолей меланомы. (A) юмм 1.7 объем опухоли с течением времени НАНЕСЕНЫ на C57Bl/6 мышей, привитые с 1 х 105 юмм 1.7 опухолевые клетки, и получать либо шесть процедур трансиммунизации (черная линия), или шесть методов управления (серая линия). Данные накапливаются в течение девяти независимых экспериментов, проведенных в течение двух лет. B) данные одного представителя юмм 1.7 трансиммуницонский эксперимент с каждой линией, показывающая рост опухоли для отдельной мыши. ( А и б) “PBS контроля” мышей во всех экспериментах были проливали кровь по тому же графику, как подопытных животных, но получил шесть стерильных PBS повторной инфузии. Бары ошибок представляют сем, p-значения, рассчитанные для каждой временной точки с помощью многократных сравнений Сидак; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Эта цифра была изменена с11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Рисунок 3: Трансиммунизация требует моноцитов и тромбоцитов в TI пластины-прошла фракция АТС, а также 8-СС лечения антиген-соответствует опухолевые клетки и 8-СС щадящие УАТС. (A) юмм 1.7 объем опухоли с течением времени НАНЕСЕНЫ на C57Bl/6 мышей, привитые с 1 * 105 юмм 1.7 опухолевые клетки, и получать либо шесть процедур трансиммунизации (сплошные черные линии), шесть контрольных процедур (сплошные серые линии), или шесть лечения Ti где моноциты или тромбоциты были истощены от УАТС до шага плиты прохода (с помощью комплектов истощения a-CD11b и a-CD41, соответственно), либо проход пластины был опущен (пунктирными линиями). (B) объем опухоли с течением времени НАНЕСЕНЫ на C57Bl/6 мышей, вакцинированных с 1 х 105 юмм 1.7 опухолевые клетки, и получать либо шесть процедур трансиммунизации (сплошные черные линии), шесть контрольных процедур (сплошные серые линии), только КПБ (пунктирная линия), 8- ШВАБРЫa-обработанных юмм 1.7 клеток в одиночку, или TI с помощью 8-швабрыA-обработанных MC38 опухолевых клеток (пунктирными линиями). (C) объем опухоли с течением времени НАНЕСЕНЫ на C57Bl/6 мышей, привитые с 1 х 105 юмм 1.7 опухолевые клетки, и получать либо шесть процедур трансиммунизации (сплошные черные линии), шесть контрольных процедур (сплошные серые линии), шесть лечения Ti, где АТС были равномерно подвержены 8-СС непосредственно перед пластиной проход, шесть процедур Ti, где АТС равномерно воздействию 8-швабры сразу после прохождения пластины, или шесть процедур, где Ti клетки после прохождения пластины были смешаны 1:1 с равное количество УАТС, которые равномерно подвержены воздействию 8-швабры облучения (пунктирными линиями). (A, B и C) “PBS контроля” мышей во всех экспериментах были проливали кровь по тому же графику, как подопытных животных, но получил шесть стерильных PBS повторной инфузии. Данные предоставляются для репрезентативных экспериментов. Бары представляют сем, P-значения, рассчитанные для каждой временной точки с помощью многократных сравнений Сидак; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , р < 0,001; , р < 0,0001; NS = различия не значительные. Эта цифра была изменена с11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Диаграмма 4: протокол TI с камерой TI быстро индуцирует созревание DC, уникальный профиль активации и активирующую способность т-клеток в АТС человека, зависящий от прохода пластины и тромбоцитов.A. FACS анализ указанных маркеров в клетках CD11c+ среди недавно изолированного человека АТС (“контроль”), АТС обработали протокол Ti (“Ti”), или TI-обработали УАТС, где пластины проход был опущен, тромбоциты были истощены с помощью Комплект шарика a-CD41 до прохода плиты, или оба из вышеуказанного были выполнены. Данные суммируют шесть независимых экспериментов с тремя донорами крови. Бары представляют собой среднее значение, в то время как полосы ошибок представляют сем. P-значения для каждого сравнения рассчитывается с помощью спаренного t-test; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Панели были изменены с11. B. тромбоцитов содержащих или тромбоцитов-обедненного Ti-ОБРАБОТАННЫХ человеческих КПЦ были совместно инкубировали ночь с неуместным (сиинфинкл) пептид, или с длинным пептидом для головы и шеи плоскоклеточный рак-АССОЦИИРОВАННЫЕ ВПЧ Е7 белка. АТС были затем использованы для стимулирования человека CD8 T ячейки линии, специально реагирующей на Е7 пептид. Стимуляция т-клеток была измерена с помощью IFNg после 5 дней культуры. (C) тромбоцитов содержащие или тромбоцитов-обедненного Ti-обработанных человеческих АТС были совместно инкубировали ночь с 8-швабрыA-обработанных головы и шеи ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫЙ карцинома клетки SCC61, либо выражая (SCC61 ВПЧ Е6/7) или не выражает (SCC61 не ВПЧ ) антигенные ВПЧ Е6 и Е7 белки19. АТС были затем использованы для стимулирования человека CD8 T ячейки линии, специально реагирующей на Е7 пептид. Стимуляция т-клеток была измерена с помощью IFNg после 5 дней культуры. (B и C) Данные показывают репрезентативные эксперименты с тремя реплицирует в каждом. Бары представляют собой среднее значение, в то время как полосы ошибок представляют сем. P-значения для каждого сравнения рассчитывается с использованием нескольких тестов сравнения Sidak; , р < 0,001; , p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Маркер Параметр Необработанной Пластина ИКК с протоколом TI Пластина TI с протоколом TI p-значение икр VS TI ХЛА-ДР Δ МФО 100,1 ± 42,4 439,8 ± 152,5 417,7 ± 152,2 Ns CD80 Δ 3,9 ± 1,1 22,3 ± 7,2 24,5 ± 7,2 Ns CD83 Δ МФО 0,3 ± 0,2 53,3 ± 9,7 51,4 ± 17,4 Ns CD86 Δ МФО 10,8 ± 1,7 103,9 ± 23,4 87,1 ± 17,6 Ns ПЛАУР Δ МФО 54,5 ± 12 721,4 ± 183,6 528,7 ± 135,5 Ns ICAM1 Δ МФО 12,2 ± 1,6 179,6 ± 28,5 192,5 ± 25,4 Ns ITGB5 Δ МФО 53,6 ± 25,7 97,1 ± 31,6 103,8 ± 32,8 Ns CCL2 (MCP-1) Δ 0,6 ± 0,5 70,1 ± 6,7 55,2 ± 8,9 Ns CXCL5 Δ 0,7 ± 0,4 39,1 ± 7,2 41,5 ± 4,7 Ns CXCL16 Δ 0,3 ± 0,2 28,0 ± 8,8 35,3 ± 11,7 Ns CD105 (эндоглин) Δ МФО 3,6 ± 0,3 124,3 ± 25,4 141,8 ± 33,2 Ns CD112 (нектин 2) Δ МФО 10,9 ± 1,8 47,3 ± 5,2 50,9 ± 9,2 Ns CD120a (тнепт-1) Δ МФО 10,1 ± 2,6 2,2 ± 1,4 1,8 ± 1,1 Ns CD137L (4-1BBL.) Δ МФО 2,9 ± 1,5 1,0 ± 0,4 1,2 ± 0,6 Ns Таблица 1: протокол Ti с камерой Ti быстро индуцирует созревание DC, эквивалентное тому, которое индуцируется протоколом Ti с клинической камерой икр. Анализ FACS изменения указанных маркеров от соответствующего контроля IgG в живых клетках человека CD11c + среди свежих изолированных АТС (“необработанных”), АТС прошел через клинические пластины ИКК после протокола TI (“пластина ИКК с протоколом TI”) и проанализировал следующую ночь инкубации, или АТС относились с протоколом TI (“TI пластины с протоколом”) и проанализированы следующие ночные инкубации. Для маркеров, таких как Хла-др, где все популяции клеток была изменена, данные выражаются как изменение в среднее интенсивности флуоресценции (МФО). Для маркеров, где только подмножество клеток выразить маркер, таких как CCL2, разница в процентах маркера-положительных клеток живой CD11c + КПВ вместо этого представлены. Данные суммируют шесть независимых экспериментов с тремя донорами крови. Данные для каждого маркера выражены как средняя погрешность в среднее (РЭМ). P-значения для каждого сравнения, рассчитанные с использованием парного теста t; NS = различия не значительные. Таблица была изменена с11. Видео 1: живое сканирование клеток тромбоцитов и иммунных взаимодействий клеток в пределах пластины TI.АТС были подготовлены, как описано в протокольной секции 2 выше, и подвергались воздействию трансиммунизации пластины, как описано в разделе 4, за исключением статического инкубационного периода в шаге 4.2.3 был сокращен с 1 ч до 30 мин. Во время протокола TI, пластина TI, которая идентична по размеру стандартному горку микроскопа, была установлена в слайд, удерживающий стадию флуоресцентной системы визуализации, и ячейки внутри нее были запечатлена при 40x увеличении и при температуре 37 ° c во время заполнения пластины (4.2.2 ), инкубации плит (4.2.3) и этапов подачи плит (4.3.5). Непрерывные изображения были приобретены и фильмы производятся с помощью “автоматизированного сканирования регулярное” программное обеспечение. Подписи под видео указывают на стадию протокола о том, что камеры снимают. Стрелки и круги в видео, с связанными подписями, указывают на ячейки и области, представляющие интерес. В нижнем правом углу на протяжении всего видео присутствует 10 мкм шкала бар. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для скачивания.)

Discussion

Миниатюрное устройство и протокол, описанные выше впервые, позволяют эффективно провести лабораторное исследование механизмов ИКЧП в экспериментальных системах мыши и в небольших образцах крови человека. Это большой аванс; Например, это позволило нам впервые продемонстрировать эффективность трансиммунизации против твердых опухолей в модели мыши 11, открывая будущую возможность аналогичного применения в онкологии человека.

До разработки устройства и метода трансиммунизации, описанного здесь, невозможно было в полной мере изучить все аспекты ИКК. В моделях мыши, хотя 8-швабра аспект терапии смог быть реплицирован несколько путем обрабатывать клетки в чашке Петри12,20, не было возможности интегрировать в метод проход плиты, который был показан к обеспечивают динамическое взаимодействие тромбоцитов, которые являются критически важными для физиологической активации ИКК, DC14. В человеческих исследованиях, альтернативно, компонент потока был полностью присутствует, но способность выборочно подвергать определенные клеточные компоненты 8-ШВАБРУA, или защитить их от него, была пропущна21,22. Это помешало полному пониманию механизма ИКК и его оптимизации иммунитета или терпимости. Кроме того, объем крови, необходимый для работы с клиническим аппаратом ИКК, является большим и препятствует научному расследованию. Миниатюрное устройство и протокол ИКК, описанные здесь впервые, позволяют эффективно, полностью гибко и с полной гибкостью моделировать моделирование ИКК. Кроме того, пластины TI позволяет в режиме реального времени визуализации и мониторинга клеточных взаимодействий в пластине с помощью микроскопии.

Для успеха протокола, используя как в естественных условиях, так и в системах ex естественных условиях, очень важно, чтобы обработаткмс содержал моноциты, которые могут быть активированы в функциональных РС. Для продолжения этой активации необходимо также обеспечить, чтобы фракция УАТС содержала физиологическое число здоровых, активационного тромбоцитов и чтобы протокол прохождения плит TI был тщательно проследил. Для того, чтобы направить вновь активированный РС в направлении конкретной реактивности, они должны быть обеспечены антигеном. Мы обнаружили, что наиболее эффективным методом антигена доставки для борьбы с раком иммунитет ночь совместного инкубации вновь активированных РС с антиген-содержащих 8-СС-подвергаетсяопухолевые клетки. Это имеет дополнительное преимущество в том, что в состоянии создать иммуногенный анти-онкологический ответ без необходимость предварительного знания опухолевых антигенов, позволяя DC, чтобы выбрать их. Однако, в тех случаях, когда антиген известен, мы имели некоторый успех в бывших системах естественных условиях при использовании свободных пептидов как антигены в совместном инкубации. Для иммуногенных приложений, сами контроллеры должны быть защищены от 8-СС воздействия . Наконец, в в естественных условиях экспериментов, важно, чтобы работать с животным модель, которая способна анти-опухолевого иммунитета. Трансиммунизация работает, создавая активированный, антиген-специфические Вмрс, которые работают в организме, чтобы инициировать врожденные и адаптивные иммунные реакции. Нарушение активности или отсутствие НК, CD4, или CD8 T клеток в обработке мышь повлияет на эффективность протокола5,11.

Хотя описанный здесь протокол является доказательством принципиального, который был оптимизирован для генетической модели опухоли для мыши, тем не менее, он раскрывает множество возможностей. Механизмы ИКК в онкологии только выяснены, и есть еще много возможностей для более глубокого понимания. В более широком смысле, способность генерировать физиологически активированной мыши и человека DC, и выборочно направлять их к антиген-специфический иммунитет имеет много потенциальных приложений, помимо рака. Способность делать то же самое, но вместо этого направлять Вмрс на толерантность к антигену, как это предлагается в том, что касается действенности самой ИКК, также имеет широкомасштабные медицинские последствия. С помощью этого метода, мы надеемся предоставить инструменты и открыть продуктивный проспект исследований для тех, кто с интересом в физиологической терапии DC.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была оказана при поддержке низ-НИР спор Грант 1 P50 CA121974 (р. Эдельсон, м. Жирарди); НИЗ онкологический центр поддержки гранта 3 P30 CA16359-28S1 (р. Эдельсон, м. Жирарди); Учебный Грант института Говарда Хьюза (а. Вассо); и кардиологический фонд Нью-Йорка (р. Эдельсон, а. Вентура, а. Васдалин, х. Эсаолин). Частичную поддержку предоставила м. Босенберг R01 CA196660-01.

Авторы благодарят доктора Роберта Тигелаара за его наставничество, руководство и экспериментальное озарение. Мы благодарим наших коллег в Фраунгофер IBMT, особенно д-р Торстен Кнолл, для разработки и предоставления эквивалентные ИКК палаты TI. Николай Феодосакис любезно помог с начальной стадией экспериментов ЮММ. Мы благодарим наших добровольных доноров крови, Ингер Кристенсен и ее профессиональные сотрудники Йельского Центра лечения ИКК за помощь в добровольческой крови закупок. Д-р Уэнделл Ярбро и д-р Наталья Иссаева любезно поделились с нами сотовыми линиями SCC61 и SCC61-6/7. Для оказания технической помощи в рамках проекта мы благодарим д-ра Джулию Льюис за рекомендации по протоколу FACS и э. Менет, г. Токмулина, к. Коте в Йельском FACS Core. Фильм изображения клеток в пределах пластины TI были приобретены при содействии Феликс Ривера-Молина, PhD, Кафедра клеточной биологии и Йельского КИНЕМАТОГРАФИЧЕСКИЕ центр визуализации, Йельской школы медицины. Кинопроизводство руководил Эндрю Осборн, старший видео продюсер, Управление связи, Йельской школы медицины.

Materials

8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 – overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 – mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 – overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 – mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 – YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 – monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 – mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 – running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 – mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 – running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 – mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 – mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edelson, R., et al. Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results. The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).
  2. Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens. The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).
  3. Scarisbrick, J. J., et al. A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent. Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).
  4. Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. Extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).
  5. Heald, P., et al. Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).
  6. Ratcliffe, N., et al. National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis. Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).
  7. Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. American council on ECP (ACE): Why now?. Journal of Clinical Apheresis. , (2018).
  8. Edelson, R. L. Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).
  9. Gasparro, F. P., Dall’Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy. The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).
  10. Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).
  11. Ventura, A., et al. Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity. Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).
  12. Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?. Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).
  13. Girardi, M., et al. Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study. Leukemia & Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).
  14. Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).
  15. Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin. Clinical & Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).
  16. Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells. Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).
  17. Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms. Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).
  18. Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell & Melanoma Research. , (2016).
  19. Gubanova, E., et al. Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival. Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).
  20. Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes. Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).
  21. Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease. Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).
  22. Berger, C., et al. Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy. Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).

Tags

Dendritic CellsPhysiologic Dendritic Antigen-presenting CellsPhDCMonocyte-to-DC ConversionPlatelet SignalingAnti-tumor T Cell ResponsesMonocyte-to-PhDC MaturationPeripheral Blood Mononuclear CellsPBMCRed Blood Cell LysisTumor-bearing Mice

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image