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Immunology and Infection

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Published: May 17, 2019
doi:
10.3791/59370
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1Department of Dermatology,Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department,University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology,Yale University School of Medicine

Summary

Die Tranmmunisierung (TI) Gerät oder Platte und verwandte Protokolle wurden entwickelt, um die wichtigsten Merkmale der extrakorporalen Photochemotherapie (ECP) zu replizieren, in einem experimentellen Umfeld, die die Produktion von physiologisch aktivierten, tausenfähigen dendritischen Zellen (DCs) für die Krebs-Immuntherapie.

Abstract

Die extrakorporale Photochemotherapie (ECP) ist eine weit verbreitete Krebs-Immuntherapie für das kutane T-Zell-Lymphom (CTCL), die in über 350 Universitätszentren weltweit operiert wird. Während die klinische Wirksamkeit und das vorbildliche Sicherheitsprofil von ECP zu seiner weit verbreiteten Anwendung geführt haben, ist die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen eine Herausforderung geblieben, die zum Teil auf das Fehlen eines Labor-ECP-Modells zurückzuführen ist. Um dieses Hindernis zu überwinden und eine einfache, benutzerfreundliche Plattform für die ECP-Forschung zu schaffen, haben wir eine verkleinerte Version des klinischen ECP-Leukozytenverarbeitungsgerätes entwickelt, das sich sowohl für die Arbeit mit beiden Mausmodellen als auch mit kleinen menschlichen Blutproben eignet. Dieses Gerät wird als Transimmunization (TI) Kammer oder Platte bezeichnet. In einer Reihe von bahnbrechenden Experimenten wurde das miniaturisierte Gerät verwendet, um einen zellulären Impfstoff zu produzieren, der regelmäßig in mehreren syngenischen Maus-Tumor-Modellen therapeutische Anti-Krebs-Immunität auslöste. Indem wir einzelne Faktoren aus dem Versuchssystem entfernen und ihren Beitrag zur In-vivo-Anti-Tumor-Reaktion feststellten, erläutern wir dann die wichtigsten mechanistischen Treiber des ECP-Immunisierungspotenzials. Gemeinsam haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass die Anti-Tumor-Effekte von ECP durch dendritische Zellen (DC) ausgelöst werden, physiologisch durch Blutmonozyten-Interaktion mit Blut-Monozyten-Interaktion mit Blutplättchen in der TI-Platte erzeugt und mit Antigenen aus Tumorzellen belastet werden, deren apoptotische Zelle Der Tod wird durch die Exposition gegenüber dem photoaktivierbaren DNA-Vernetzungsmittel 8-methoxypsoralen und UVA-Licht (8-MOP A) fein geneigt. Wenn dieser zelluläre Impfstoff an die Maus zurückgegeben wird, führt er zu einer spezifischen und übertragbaren Anti-Tumor-T-Zell-Immunität. Wir haben überprüft, dass die TI-Kammer auch für die menschliche Blutverarbeitung geeignet ist, wodurch menschliche DCs entstehen, die in Aktivierungszustand und Profil mit denen aus der klinischen ECP-Kammer voll vergleichbar sind. Die hier vorgestellten Protokolle sind für ECP-Studien in Maus und Mensch, kontrollierte Generierung von apoptotischen Tumorzellen mit 8-MOPA unddie schnelle Produktion von physiologischen menschlichen und mäusermonozyzaztischen DCs für eine Vielzahl von Anwendungen bestimmt.

Introduction

Die extrakorporale Photochemotherapie (ECP) ist eine etablierte Immuntherapie, die in universitären Zentren weltweit weit verbreitet ist. Sein Einsatz wurde von der einzigartigen Selektivität, Sicherheit und bidirektionalen Wirksamkeit der ECP-Therapie angetrieben, Eigenschaften, die ECP mit dem physiologischen Immunsystem selbst teilt, mit dem es zu Partner zu sein scheint. ECP immunisiert gezielt gegen die bösartigen Zellen im Hautzell-Lymphom (CTCL)1,2und tolerisiert gezielt nach gezielten Antigenen in den Transplantations-, Autoimmun-und Graft-versus-Wirst-Erkrankungen (GvHD) 3 , 4. Die Immunogenität von ECP wird durch die Abhängigkeit von einem intakten CD8-T-Zellfach in CTCL 5 unterstrichen, während sich die Spezifität in ECPessehr günstigem Nebenreaktionsprofil widerspiegelt, ohne dass es bei der Transplantation eine Immunsuppression außerhalb des Ziels gibt oder GvHD-Einstellungen und keine erhöhte opportunistische Infektionsanfälligkeit in CTCL, wo nicht-pathogene T-Zellklone zusammen mit den bösartigen T-Zellen möglicherweise verloren gehen könnten.

Angesichts der klinischen Bedeutung von ECP hat die Hoffnung, dass ein besseres Verständnis seiner Mechanismen die therapeutische Reichweite von ECP auf ein breiteres Spektrum von Krebserkrankungen und immunologischen Störungen ausweiten könnte, internationales Interesse geweckt. Zwei landesweit sanktionierte Workshops, ein State-of-the-Science Symposium 6 der National Institutes of Health (NIH) und eine American Society for Apheresisconsensus conference 7, wurden durchgeführt und berichtet, mit dem Ziel, die Identifizierung der wichtigsten zellulären Beiträge zu ECP es Anti-Krebs-und tolerogenen Wirkungen.

Trotz zahlreicher veröffentlichter Berichte, die versuchen, den ECP-Mechanismus zu bekämpfen, haben bisher zwei primäre Hindernisse den wissenschaftlichen Fortschritt behindert. Erstens wurde die Untersuchung der ECP-Mechanismen im Versuchslabor durch den Mangel an Miniatur-ECP-Geräten eingeschränkt, das die Zell-und In-vivo-Wirkung von ECP vollständig widerspiegelt und auf Tiermodelle anwendbar ist. Zweitens wurde die eingehende Laboranalyse von ECP-Proben im klinischen Umfeld durch die begrenzte Verfügbarkeit von ECP-verarbeiteten Patientenimmunen eingeschränkt, die Zugang zu Behandlungszentren erfordern und zusätzlich dem Zeitpunkt der Die Infusionen des Patienten und das ethische Bedürfnis nach kompromisslosen Patientensätzen von entzündlichen Leukozyten.

Um die Hindernisse zu beseitigen, die den Fortschritt der ECP-Forschung behindern, haben wir uns vorgenommen, einen Miniatur-ECP-Apparat zu entwickeln, der die Schlüsselelemente der Therapie am engsten nachahmt. Die Standard-ECP-Behandlung beinhaltet die Durchquerung von leukapheresis-angereicherten Leukozyten eines Patienten durch eine 1 mmdicke, ultraviolette A-Licht (UVA)-transparente, Kunststoffplatte6,8. In der Platte sind die Leukozyten 8-Methoxypsoralen (8-MOP) ausgesetzt, einem lichtaktivierbaren Wirkstoff, der bei der UVA-Exposition vorübergehend in eine reaktive Form umgewandelt wird (8-MOPA), die in der Lage ist, die DNA über ihre bivalente Bindung an Pyrimidin-Basis zu vernetzen. Schwester DNA-Stränge9,10. Verarbeitet werden 8-MOP A-behandelte Leukozytengesammeltund intravenös an den Patienten zurückgegeben.

Da es sich bei ECP selbst um eine bidirektionale Therapie handelt, die bei Krebs immutiert und in Transplantationen, Autoimmunität und GvHD-Einstellungen tolerisiert, haben wir den Immunisierungsmodus des ECP als “Trangunisierung” und den tolerogenen Modus “Transplanertisierung” bezeichnet. Wir konzentrierten uns zunächst auf die Tranventionierungsmodalität. Unser kürzlich gemeldetes miniaturisiertes, skalierbares Mäuse-zu-Mensch-ECP-Gerät, die Transulationskammer (TI)-Kammer oder-Platte, und das entsprechende Protokoll, reproduzieren sowohl die zellulären als auch in vivo-Effekte des menschlichen ECP-Geräts in einer Krebseinstellung11.

Um die Tranmmunisierung im vivo-Modell so klinisch wie möglich relevant zu machen, haben wir die Immuntherapie eingeleitet, nachdem subkutane injizierte syngenische Maus-Tumoren spürbar wurden und so die Wirksamkeit des Protokolls bei etabliertem Krebs getestet wurde. Ähnlich wie ECP in CTCL verwendet auch das Proof-of-Protes-Tranmmunisierungsprotokoll im YUMM1.7-Melanom-Modell periphere blutmononuklare Zellen (PBMC) von tumortragenden Tieren. Die Zellen werden unter dem Flow durch die TI-Platte geleitet. Während eine 8-MOP Eine Behandlung von Zellen in der Miniaturkammer möglich ist, ist es besser, sie separat zu führen, um sicherzustellen, dass nur der gewünschte Zelltyp 8-MOP Aausgesetztist. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die tolerogene Wirkung von ECP durch 8-MOP A-verletzte Antigen-Präsenzzellen12vermittelt wird, während die immunisierende Wirkung eine Verletzung der Zieltumorzellen11erfordert. Im Tranmunierungsprotokoll können entweder die Tumorzellen oder die Immunzellen bei Bedarf selektiv 8-MOP Aausgesetzt werden. Da sich gezeigt hat, dass die Maximierung der Berührungszeit zwischen 8-MOP A-verletzte Tumorzellen und ECP-induzierte dendritische Zellen (DC) die immuntherapeutische Kapazität des klinischen ECP13deutlich erhöht hat, haben wir über Nacht eine Die Mitinkubierung tritt in unser Protokoll ein. Nach der nächtlichen Inkubation werden die behandelten Zellen wieder an das tumortragende Tier zurückgegeben.

Dieses System reduzierte zuverlässig das Tumorwachstum und leitete eine spezifische Anti-Tumorimmunität bei Mäusenmitetablierten syngenischen Tumoren 11 ein und ermöglichte es uns, den Mechanismus der klinischen Anti-Tumor-Wirksamkeit von ECP zu zerlegen. In mehreren Studien haben wir gezeigt, dass die ECP-Immunität durch die Ex-vivo-Platelet-Aktivierung in der TI-Platte14,15eingeleitetwird. Aktivierte Blutplättchen signalisieren anschließend die monozyten-zu-dendritische Zellreifung14, was zur Produktion physiologischer DCs führt. Die neu gebildeten monozytenabgeleiteten DCs sind in der Lage, verinnerlichte verinnerlichte Antigene aus 8-MOP A-geschädigten Tumorzellenzu kreuzen, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen zu aktivieren 16. Wie bereitsvorgeschlagen 12,17, können jedoch 8-MOP A-induzierte Schäden an den aufkommenden DCs selbst dem Anti-Tumor-Effekt 11 entgegenwirken oder sogar umkehren, was eine mechanistische Verbindung zur ECP-Toleranzdarstellt.

Die TI-Platte wurde auch zur Herstellung physiologisch aktivierter DCs aus humanem PBMC verwendet. Ähnlich wie bei den Mausstudien sind menschliche TI-abgeleitete DCs in Anwesenheit von Blutplättchen für ihre Generation von der Platte-Passage abhängig, erscheinen phänotypisch identisch mit denen, die in der klinischen ECP-Platte produziert werden, und sind in der Lage, effizient zu verarbeiten und Die Darstellung menschlicher Tumorantigene zur Aktivierung der menschlichen T-Zellen11,16.

Mit der Aufdeckung des Mechanismus der ECP-Immuntherapie haben wir daher eine Methode entdeckt, mit der physiologische Maus und menschliche dendritische Zellen mit gewünschter Antigen-Spezifität schnell erzeugt werden können, die funktionell moduliert werden können. Das innovative TI-Gerät und-Protokoll hat eine wesentliche potenzielle Bedeutung in den Bereichen ECP-Forschung und-Therapie und Krebs-Immuntherapie im weiteren Sinne und in jedem anderen Bereich mit Interesse an physiologischen, funktionellen dendritischen Zellen in der Immunisierung oder Die tolerikale Modalität. Wir hoffen, dass diese Publikation denjenigen, die sich für solche Forschungsbereiche interessieren, die notwendigen Instrumente zur Verfügung stellen wird.

Protocol

Alle hier beschriebenen Mausmethoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Yale University in Übereinstimmung mit den National Institutes of Animal Healthcare Guidelines genehmigt. Alle menschlichen Studien wurden mit Blut durchgeführt, das von gesunden Freiwilligen gespendet wurde, mit schriftlicher Einwilligung. Menschliche Blutstudien wurden nach anerkannten ethischen Richtlinien durchgeführt (z.B. Deklaration von Helsinki, CIOMS, Belmont-Bericht, U.S. Common Rule) und wurden von Yale Human Investigational Review Board unter der Protokollnummer 030101010636 genehmigt. NOTE: Im Folgenden finden Sie das Protokoll zur Beschreibung der Transimmunisierung zur Anti-Tumor-Therapie von Maus-Syngensäkumoren. 1. Syngeneic YUMM1.7 Tumor Implantation Folgen Sie den etablierten Protokollen, um Syngeneiz-Tumore in die Flanken von Mäusen einzupflanzen, die der Tumorzelllinie entsprechen.NOTE: Das folgende Protokoll beschreibt das YUMM1.7 C57BL/6 Maus Melanom-Tumor-Modell. Die Melanomzellen YUMM1.7 wurden freundlicherweise von Dr. Bosenberg, Yale18, bereitgestellt. Tauen Sie ein gefrorenes Aliquot von Zellen und verwenden Sie Zellen nach einer Zelle Passage. Kultur frisch aufgetaute YUMM1.7-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Nährstoffgemisch F-12 Medium (DMEM/F12), Ergänzt mit 10% hitzinaktiviertem fetalen Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin und 1% nicht-essenzieller Aminosäuren, unter Standard Gewebekultur-Bedingungen (37 ° C, 5% CO2). Sammeln Sie YUMM1.7 Zellen bei 60\ 201270% Zusammenfluss, indem Sie genug Trypsin-EDTA hinzufügen, um den Boden der Zellkultur-Platte oder-Flasche zu bedecken (z.B. 4 mL für eine T75-Flask). Die Zellkultur-Gefäße bei Raumtemperatur für 3\u20124 min ruhen, sanft auf den Boden oder die Seiten des Gefäßes abklopfen, um die Zellen zu lösen. Fügen Sie 1 ml fetales Rinderserum (FBS) pro 4 ml Trypsin-Ethylenediaminetetraacetikinsäure (EDTA) hinzu, um die Reaktion zu stoppen, sobald die meisten Zellen abgelöst sind. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie in ein 15 ml konisches Rohr pipettieren. Die Flasche mit phosphatgepufferter Saline (PBS) abspülen und die Spülung in das gleiche Sammelrohr geben. Die Röhre mit PBS auf 15 ml füllen. Nehmen Sie einen kleinen Aliquot heraus und zählen Sie die Zellen. Drehen Sie 10 min bei 250 x g in eine Standard-Gewebekultur-Zentrifuge, um die Tumorzellen zu sammeln. Resuspend YUMM1.7 Zellen in PBS bei einer Dichte von 1 x 106 cells/mL. 1 x 105 YUMM1.7 Tumorzellen subkutan in 100 μL PBS in die rechte Flanke des Empfängers von 4 bis 6-wöchigen Wildpflanzen vom Typ männlichen C57BL/6J, Narkose nach institutionellen Richtlinien (z.B. 3\u20125% isofluranisches Inhalstoffgas, Anästhesie Bestätigt durch den Mangel an Hinterpfote Prise Reflex). Überwachen Sie das Tumorvolumen durch zweiwöchige Messungen der senkrechten Tumordurchmesser und-höhe mit einem Kaliber. Berechnen Sie YUMM1.7 (Tumorvolumen als Tumorlänge x Breite x height)/2. Initiieren Sie eine Tranvermmunisierungstherapie, wenn Tumoren einfach spürbar werden; Für YUMM1.7 Tumoren, ist dies in der Regel Tag 7\u201210 Post-Tumor-Implantation. 2. Sammlung von peripheren Blutmononuclear Zellen für die Transimmunisierung Sammeln Sie 100\u2012150 μL Blut von jeder tumortragenden Maus über die Wange bluten. Wenn Blut gesammelt wird, wird das Blut jeder Maus-Behandlungsgruppe (je 5 experimentelle Mäuse + 5 Kontrollmäuse) in einem einzigen 15 mL-Schlauch mit 5.000 U/mL-Heparin abgelegt. Verwenden Sie 10 μL von 10% Heparin pro 100 μL Blut gesammelt.NOTE: Mischen Sie die Röhre häufig während der Einnahme, um Blutgerinnung zu vermeiden. Während die Kontrolle tumorhaltiger Mäuse gleichzeitig mit den experimentellen Mäusen geblasen werden kann, um gleiche Bedingungen mit der Behandlungsgruppe zu gewährleisten, kann das “Kontrollblut” entweder entsorgt werden, oder mit dem Blut der Behandlungsgruppe kombiniert werden, um zusätzliche Experimentelle PBMC für die Behandlungsgruppe, nach Ermessen der Ermittler. Richten Sie ein 15-ML-Rohr mit 4 ml Lymphozyten-Isolationsmittel ( siehe Materialtabelle) pro 5\u201210 Mäuse. Langsam Schicht Blut (von tumortragenden Mäusen gesammelt) auf dem Medium. Drehen Sie die Zellen 20 min bei 1000 \u20121.500 x g, um das PBMC von roten Blutkörperchen zu trennen. Sammeln Sie am Ende der Zentrifugation die obere Plasmaschicht, lassen Sie ~ 0,5 mL über dem Puffenmantel liegen und lagern bei 4 ° C für die spätere Verwendung (Schritt 7.1 ). Sammeln Sie die Puffenschicht in ein sauberes 15-mL-Rohr, füllen Sie mit PBS bis 15 ml und drehen Sie 10 min bei 250 x g in einer Standard-Gewebekultur-Zentrifuge, um die PBMC zu sammeln. Das Supernatant vorsichtig abkippen und das Pellet wieder aufleben lassen, indem man die Röhre flickt. Nicht dekantieren, da das Pellet weich ist und verloren gehen kann. Fügen Sie 2 mL des ACK roten Blutkörperchen Litur-Puffer (siehe Tabelle der Materialien) in die Röhre, um alle verbleibenden roten Blutkörperchen aus dem PBMC zuentfernen. Auf Eis 10 min inkubieren. Füllen Sie die Röhre mit PBS bis 15 mL und drehen Sie die Röhre 10 min bei 250 x g in einer Standard-Gewebekultur-Zentrifuge, um die PBMC zu sammeln. Das äß vom Supernatant abwerfen und das Pellet durch Flicken wieder aufleben lassen. Nicht dekantieren, da das Pellet weich ist und verloren gehen kann.NOTE: In diesem Schritt kann der gereinigte PBMC so modifiziert werden, wie es am besten zum Experiment passt. Die verschiedenen PBMC-Komponenten (Blutplättchen, Monozyten, andere Immunzellen) können bei Bedarf entkleidet oder vom PBMC isoliert werden. Außerdem kann PBMC selbst 8-MOP Aausgesetztwerden, entweder vor oder nach Abschnitt 4 (vor oder nach der Plattenpassage — nach Abschnitt 2 oder vor Abschnitt 5), indem man den Protokollschritten 3.3\u20123.8 folgt und PBMC durch YUMM1.7-Zellen ersetzt. Dadurch wird die immunogene Kapazität der Behandlung verkürzt und stattdessen die Immuntoleranz gefördert. Für jede Behandlungsgruppe (je 5 Versuchsmäuse + 5 Kontrollmäuse), teilen Sie das PBMC-Pellet in 300 μL FBS neu. 3.8-MOP/UVA-Behandlung von Tumorzellen Kultur und sammeln YUMM1.7 Tumorzellen, wie in den Schritten 1.2 – 1.3 beschrieben, um eine 8-MOP A-exponierte Tumorzell-Antigen zu erstellen. Bereiten Sie 2,5 x 106 YUMM1,7 Tumorzellen pro Behandlungsgruppe von 5 Mäuse vor. Für jede Behandlungsgruppe wird das Tumorzellenpelllet in FBS bei 2,5 x 106 Cells/300 μL (~ 8,33 x 106 cells/mL) wiederbelebt. Mit den ausgeschilfen Gewebekultur-Kapuzen können Sie der YUMM1.7-Tumorzellaufhängung 8-MOP hinzufügen, um eine endgültige 8-MOP-Konzentration von 100 ng/mL zu erreichen.CAUTION: 8-MOP ist ein fotoaktivierbares DNA-schädigendes Mittel und krebserregend. Seien Sie beim Handling und beim Dosierung Vorsicht geboten, vermeiden Sie den Kontakt mit der exponierten Haut und werfen Sie entsprechend ab. Die Zellen gut vermischen, den Zellbehälter in Zinnfolie wickeln und bei 37 ° C 20 Minuteninkubieren. Eine 12-Brunnen-Gewebekultur-Platte vorbeschichten, indem man eine gut für jede Behandlungsgruppe von 5 Mäusen (2,5 x 106 YUMM1.7 Tumorzellen) mit 1 ml FBS füllt und gefüllte Platte für 20 min bei 4 °C kühl. Schalten Sie die UVA-Lichtquelle ein, um sie vorwärmen.CAUTION: UVA-Licht ist ein krebserregendes. Arbeiten Sie bei der Arbeit mit UVA-Lichtquellen schnell und sorgfältig, schützen Sie die Haut vor der Exposition und verwenden Sie Gesichtsschilde oder Brillen, um Gesicht und Augen zu schützen. Nach 20 Minuten die gekühlte 12-well-Platte (Schritt 3,5) auf die Gewebekulturhaube bewegen, FBS aus Brunnen entfernen und 300 μL (2,5 x 106 Cells/) MOP-exponierte Tumorzellen (ab Schritt 3,4) pro Brunnen hinzufügen. Die zellhaltige Platte der vorgewärmten UVA-Lichtquelle für die totale Bestrahlung von 4 J/cm 2 aussetzen.NOTE: Die hier beschriebene 8-MOP-Konzentration und UVA-Dosis sind für die Tumorzelllinie YUMM1.7 kalibriert. Eine Titration von 8-MOP/UVA-Dosis, die ausreicht, um innerhalb einer Woche nach der Exposition 100% Tumorzellentnahme zu verursachen, sollte für jede experimentelle Tumorzelllinie durchgeführt werden, um eine wirksame Tötungsdosis zu bestimmen. Dies ist für die Maus in vivo-TI-Experimenten von entscheidender Bedeutung, da die Zellen rückwärts orbital (Schritt 6.1) reinjiziert werden und somit alle unbeschädigten Tumorzellen sonst beim behandelten Tier Augentumore bilden können. Als Richtwert ist 4\u20128 J/cm 2 der UVA, 100\u2012200 ng/mL 8-MOP, der typische Wirkungsbereich für die meisten Tumorzelllinien. Sammeln Sie 8-MOP A-behandelteTumorzellen aus jedem Brunnen, wirbeln Sie die Platte und Pipettieren sorgfältig, um eine vollständige Zellwiederherstellung zu gewährleisten. 4. TI Platte Passage der Zellen Für jede Behandlungsgruppe von 5 Mäusen, kombinieren Sie in einem 1,5 mL konischen Rohr 300 μL des entsprechenden PBMC (ab Schritt 2.11) und 300 μL 8-MOP A-behandelte Tumorzellen (ab Schritt 3.9). Die Zellen mischen. Verwenden Sie eine 10 mL-Spritze, um die “Eingang” und “Ausgang”-Sets von TI-Schlauch zu füllen (siehe dieTabelle der Materialien) Mit FBS. Öffnen Sie die Schlauchklemmen, um die Rohre zu füllen, und schließen Sie die Klemmen, sobald die Rohre gefüllt sind, bevor Sie die Spritze trennen, um FBS im Schlauch zu halten. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um den PBMC und den Tumorzellmix (ab Schritt 4.1) auf die TI-Platte zu setzen (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Platte in einem 45° -Winkel, legen Sie die Pipette-Spitze sicher in die TI-Plattenaufnahme, und füllen Sie die Platte langsam, um Blasen zu vermeiden. Entfernen Sie die Pipette-Spitze aus der Einnahme, bevor Sie den Pipette-Kolben freigeben. Die Platte hält 450 μL; Die restlichen Zellen in den 1,5 ml konischen Rohr zurückgeben. Inkubieren Sie die FBS-gefüllten Schläuche, die mit Zellen gefüllte TI-Platte und die 1,5 ml konische Röhre, die die restlichen Zellen im Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C für 1 Stunde enthält. Nach der Inkubation leeren Sie die TI-Schlauch durch die Schwerkraft und lösen die Klemmen aus. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um Zellen von der TI-Platte zu entfernen, indem Sie die Pipette-Spitze mit dem Kolben depressiv in den Plattenport einfügen. Halten Sie die Platte in einem 45°-Winkel und füllen Sie die P1000-Pipette-Spitze. Legen Sie die Zellen wieder in ihre ursprüngliche 1,5 ml konische Röhre. Um die TI-Platte laufen zu lassen, verbinden Sie das Auslaufrohr mit der Platte und sichern Sie die TI-Platte in das Plattenlaufsystem. Mit einer 1 ML-Spritze die 600 μL PBMC und Tumorzellmischung aus dem 1,5 ml konischen Rohr aufzeichnen, Blasen in der Spritze loswerden, die Spritze mit geöffneter Klemme an das Eingangsrohr anbringen und langsam füllen, bis die Flüssigkeit das Ende des Schlauches erreicht. Das freie Ende des Eingangsrohrs an die TI-Platte befestigen und das restliche Volumen weiter schonend laden. Schließen Sie die Eingangsklemme. Die 1 ml Spritze ablösen und die Eingangsschläuche mit der Spritzenpumpe verbinden. Sichern Sie den Ausstiegsschläuche auf ein sauberes 1,5 ml konisches Rohr für die Zellentnahme. Stellen Sie die Spritzenpumpenmenge auf 0,09 mL/min ein, starten Sie die Pumpe aber noch nicht. Mit einer TI-Platte oder anderen Mitteln (z.B. einem kleinen flachen Objekt unter einem Ende der Platte) wird die TI-Platte ~30 ° auf die Spritzenpumpenseite gekaut. Die Klemme an der Eingangsschläuche vorsichtig lösen. Starten Sie die Spritzenpumpe, beobachten Sie sorgfältig, wie sich die TI-Platte füllt, und flicken Sie Schläuche oder Teller, wenn Luftblasen den Fluss behindern. Sobald die TI-Platte vollständig gefüllt ist, kippen Sie sie ~30 ° in die entgegengesetzte Richtung, während sie sich entleert. Wenn alle Zellen und Flüssigkeit im 1,5 ml konischen Sammelrohr sind, stoppen Sie die Pumpe. Um die TI-Platte zu waschen, trennen Sie die Eingangsschläuche von der Spritzenpumpe, verbinden Sie sich mit einer 1 ml Spritze, die mit 600 μL FBS gefüllt ist, und folgen Sie dem Verfahren für die Schritte 4.8\u20124.9. Stellen Sie die Spritzenpumpenmenge auf 0,49 mL/min ein, lassen Sie die Eingangsklemme los und führen Sie die TI-Platte wie in den Schritten 4.12\u20124.13 beschrieben, wobei die Wäsche in der gleichen 1,5 mL konischen Röhre gesammelt wird. Flicken oder tippen Sie sanft die TI-Platte die ganze Zeit, um zu helfen, die hinteren Zellen zu lösen und zu entgleisen. Die Sammlung 1,5 ml konische Röhre in der Benchtop-Mikrofuge mit 250 x g für 8 min auflösen. 5. Vorbereitung der Autologous Mouse Serum für die Kultur über Nacht Medium Sammeln Sie Blut von 10\u201212 Woche alten C57BL/6J-Mäuse mit jeder institutionell zugelassenen Methode (z. B. Augenbluten, Schwanzvene bluten, Wangenbluten, oder Endausbluten durch Herzpunktion), ohne Antikoagulantien. Prompt das Sammeln von 1 mL Blut für jede 300 μL Serum benötigt.NOTE: Für jede Behandlungsgruppe von 5 Mäusen würde man 300 μL Serum im Experiment benötigen. Lassen Sie das Blut über Nacht bei 4 ° C verstopfen. Drehen Sie das gerinnte Blut bei 3.000 x g für 15 min. Sammeln Sie vorsichtig die obere serumhaltige SchichtNOTE: Serum kann sofort verwendet werden, um das Brutmedium der Übernachtungszelle (Schritt 6.1) zu erstellen, oder für zukünftige Experimente konserviert werden. Um das Serum zu erhalten, frieren Sie in Aliquote bei-20 ° C. 6. Übernachtung Mitinkubation von PBMC mit Antigen Resuspend das PBMC und Tumorzellpellet (Schritt 4.5) in 2 mL klarem RPMI mit 15% autologischem Mausserum (in Schritt 5 vorbereitet). Platte in einer 35 mm nicht-gewebten Kultur behandelt sterile Schale, und inkubieren über Nacht unter Standard-Gewebekultur-Bedingungen (37 ° C, 5% CO2).NOTE: Wenn PBMC mit einem nicht-zellulären Antigen (Peptid, Nanopartikel, Protein, etc.) verwendet wird, unterlassen Sie Abschnitt 3 des Protokolls und gehen Sie von Abschnitt 2 direkt zu Abschnitt 4, indem Sie das gewünschte Antigen in das TI-Platten übergeben PBMC für die nächtliche Mitinkubation hier in Schritt 6.1. Am nächsten Tag lösen Sie die anhaftenden Zellen sorgfältig vom Boden der Schale mit einem Gewebekultur-Schrott ab und drehen die Schale beim Kratzen, um eine gleichmäßige Zellentnahme zu gewährleisten. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 mL Rohr. Fügen Sie 2 mL PBS in die Schüssel und wiederholen Sie den Kratzschritt, sammeln die Zellen in der gleichen Röhre. Die 35-mm-Schale mit 1 mL PBS abspülen und die Spülung in die gleiche Röhre geben. Drehen Sie 10 min bei 250 x g in einer Standard-Gewebekultur-Zentrifuge, um die Zellen zu sammeln. Das Supernatant vorsichtig abkippen und das Pellet wieder aufleben lassen, indem man die Röhre flickt. Nicht dekantieren, da das Pellet weich ist und verloren gehen kann. 7. Wiedereinspritzung von TI-behandelten Zellen in Tumorträger-Mäuse Das autologe Plasma (in Schritt 2.4 vorbereitet) bei 750 x g für 15 Minuten abspülen, um alle Partikel zu sediment zu senken. Das Zellpellet (ab Schritt 6.4) in 600 μL autologem Plasma oder PBS wiederverwenden. In den Retro-Orbital-Plexus von entsprechend anästhetisierten (z.B. 3\u20125% Isofluran-Inhalant Gas, Anästhesie, die durch den Mangel an Hinterpflader-Flitzreflex bestätigt wird) können tumortragende Genosgemische mit 100 μL pro Maus injiziert werden. Auf Wunsch können Sie Tumorlagermäuse mit 100 μL autologem Plasma allein oder PBS erneut injizieren. Bei YUMM1.7 tumorhaltigen Mäusen – die Behandlung zweimal pro Woche für 3 Wochen wiederholen, für insgesamt 6 Behandlungen. Sammeln und verarbeiten Sie den PBMC von tumorhaltigen Mäusen wöchentlich (Protokollabschnitte 2\u20124) montags und donnerstags und geben Sie die Inkubation nach der Übernachtung wieder auf (Protokollabschnitte 5\u20127) am Dienstag und Freitag.NOTE: Dieses BehandlungsproPrägesystem wurde für die spezifische Wachstumskinetik von YUMM1.7 Tumoren bei Mäusen entwickelt. Es kann für andere Tumorsysteme mit langsameren oder schnelleren Tumorwachstumsraten zugeordnet werden — bzw. die Anzahl der Behandlungen erhöhen oder reduzieren. Das Tumorvolumen über zweiwöchige Messungen überwachen — vorzugsweise zum Zeitpunkt der Therapiemattung (Dienstag und Freitag) — senkrechter Tumordurchmesser und Höhe mit einem Sattel. Beenden Sie das Experiment, wenn die Kontrolle der Tumorvolumina die maximale Größe erreicht, die durch institutionelle Richtlinien und Protokolle erlaubt ist. 8. Protokollanpassung zur Behandlung von kleinen Volumina menschlichen Blutes Passen Sie das Protokoll für den Einsatz mit menschlichen Zellen an, indem Sie zunächst PBMC von menschlichem Blut isolieren. Verwenden Sie heparin als Anti-Gerinnungsmittel, mit jedem bevorzugten PBMC-Isolationsprotokoll. Stellen Sie sicher, dass der isolierte PBMC-Fraktionsanteil eine physiologische Anzahl von Blutplättchen enthält, um die besten Protokollergebnisse zu erzielen. Überwachen Sie die Anzahl der Blutplättchen vor und nach der PBMC-Isolierung mit jedem Standard-Hämatologie-Zähler. Wenn Sie eine menschliche zelluläre Antigen-Quelle verwenden, behandeln Sie die menschlichen antigenen Zellen nach den Schritten, die in Abschnitt 3 für YUMM1.7-Zellen beschrieben sind. Titrate 8-MOP und UVA-Dosen entsprechend. Führen Sie die in Abschnitt 4 beschriebenen Tplate-Durchgangsschritte mit bis zu 3x 10 7 PBMC pro TI-Platte durch. Kultur PBMC über Nacht mit Cellular/anderen Antigen der Wahl, wie in Abschnitt 6 beschrieben, aber ersetzen 15% menschliches AB-Serum für autologisches Maus-Plasma für das Übernachtungskulturmedium in Schritt 6.1. Verwenden Sie die resultierenden Zellen in jedem gewünschten Test. Zum Beispiel die Ko-Kultur mit antigen-reaktiven T-Zellen, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen zu beobachten, die von den TI-behandelten Zellen initiiert wurden.

Representative Results

Vor kurzem haben wir ein mausgedünktes Miniatur-ECP-Gerät, die TI-Platte (Abbildung 1A), entwickelt und entsprechende Behandlungsprotokolle entwickelt. Das Gerät und das Protokoll reproduzieren die wichtigsten zellulären und in vivo-Features der Immunisierung ECP, als “Tranvermmunisierung”. Der Beweis für das Prinzip der Murin-Tranmmunitionsprotokoll11 (Abbildung 1B) besteht aus extrakorporealen TI-Plattendurchgängen von peripheren blutmononuklearen Zellen (PBMC) von tumortragenden Mäusen zusammen mitapoptotischen 8-MOP A – ausgesetzt Tumorzellen. Insbesondere ist die TI-Kammer transparent und so dimensioniert, dass sie dem Standard-Mikroskopie-Dia-Format entspricht, was eine einfache Visualisierung von Zellinteraktionen innerhalb der TI-Platte an jedem beliebigen Punkt des Protokolls ermöglicht (Video 1). Die TI-plate-aktivierten Immunzellen werden über Nacht mit den 8-MOP A-exponierten apoptotischen Tumorzellen bebrütet, was die Aufnahme, Verarbeitung und Übertragung von Tumorantigenen in die DCs erleichtert. Am darauffolgenden Tag wird das mitinkubierte Zellgemisch wieder in den Blutstrom des tumortragenden Tieres zurückgeführt. Kontrolliere Tiere durchlaufen identische Blutentnahmeleitungen, um sich für alle Auswirkungen der Lymphodeffekte auf das Tumorwachstum zu normalisieren, erhalten aber stattdessen PBS-Wiedereinspritzungen. Das Tumorwachstum bei allen Tieren wird während des gesamten Experiments überwacht. In Studien mit dem YUMM1.7 syngenem Murine MelanomaModell 18wurde das Tranmmunisierungsprotokoll zweimal wöchentlich über drei Wochen wiederholt, für insgesamt sechs Behandlungen in jedem Tier (Abbildung 1B). Die Therapie erschien bei allen behandelten Tieren (& gt;100) gut verträglich und zeigte immer wieder eine Reduktion des YUMM7-Tumorwachstums bei behandelten und kontrollierten Tieren, wie sie in 9 unabhängigen Experimenten beobachtet wurde, die über 2 Jahre durchgeführt wurden (Abbildung 2A,B). Die Ergebnisse zeigen kumulierte Tumorwachstumsdaten in Tranmisierungsbehandelten und steuern Tiere über alle durchgeführten Experimente (Abbildung 2A) sowie repräsentative Tumorwachstumskurven für einzelne Tiere innerhalb eines Experiments, um einen Sinn zu vermitteln. Variabilität im System (Abbildung 2B). Wir haben festgestellt, dass der Erfolg des Protokolls entscheidend von der Anwesenheit von Monozyten im behandelten PBMC, dem Vorhandensein von Blutplättchen in der PBMC-Fraktion und dem Schritt der TI-Platte abhängt. Wenn die Plattenpassage weggelassen wird, oder wenn entweder Blutplättchen oder Monozyten aus dem PBMC-Fraktionsanteil erschöpft sind, wird die therapeutische Wirkung nicht mehr beobachtet (Abbildung 3A). Die Behandlung erfordert auch das Vorhandensein von apoptotischen Tumorzellen. Es ist unwirksam, wenn entweder die Immunzellen oder eine Antigen-Quelle vorhanden ist, oder in Gegenwart von falsch abgestimmtem Antigen, zum Beispiel, wenn Mäuse mit YUMM1.7-Tumoren mit MC38-Dickdarmkarzinomzellen behandelt werden (Abbildung 3B). Für ein immunierendes Ergebnis ist es auch entscheidend, die PBMC-Exposition bei 8-MOPA zuvermeiden. 8-MOPA-exponierte PBMC entlarven nicht nur oder möglicherweise sogar umgekehrte, Anti-Tumor-Immunität (Abbildung 3C), sondern hemmen auch das Immunisierungspotenzial von nicht exponierten Zellen, wie im Experiment, wo einegleiche Anzahl von 8-MOP A-exponiert und 8-MOP Es wurde ein-geschützter PBMC ohne beobachtbare Anti-Tumor-Wirkung “verwendet (Abbildung 3C). Die TI-Kammer und das Transulierprotokoll führen bei der menschlichen PBMC zu einer erfolgreichen Monozyten-Aktivierung in DC, die durch die Zelloberfläche und intrazelluläre Aktivierungsmarker von der klinischen ECP-Platte (Tabelle 1) nicht zu unterscheiden ist. Wie in den Mausstudien hängen die DC-Aktivierung (Abbildung4A) und die Fähigkeit von transimmunizationsgenerierten DCs, Antigen (Abbildung 4B,C) zu verarbeiten und darzustellen, entscheidend von der Anwesenheit von Blutplättchen im PBMC und von der TI-Plattenpassage ab. Die Transimmunization-aktivierten menschlichen DCs können entweder Peptid-Antigene (Abbildung 4B) oder Antigene aus ganzen 8-MOP A-exponierten menschlichenTumorzellen effektiv verarbeiten und kreuzen, um menschliche antigen-spezifische T-Zelllinien in vitro zu aktivieren. Assays (Abbildung 4C), in einer TI und platelet-abhängigen Weise (Abbildung 4B,C). Abbildung 1: Transimmunisierung (TI) Kammer und Protokollschemata. A) Diagramm und Spezifikationen der Tranvermmungsbehandlungskammer (TI-Platte). (B) Schematische Beschreibung der Transimmunitionsbehandlung experimenteller Arbeitsablauf. Kurz gesagt, Tiere werden subkutan geimpft (s.c.) mit syngenischen Tumorzellen; Tiere mit spürbaren Tumoren werden zweimal wöchentlich durch Blutentnahme, Isolierung von PBMC vom Blut, PBMC-Flow-Durchgang durch die autologe platelet-beschichtete TI-Platte in Anwesenheit von 8-MOP/UVA behandelten Tumorzellen, PBMC und Tumorzell-Ko-Inkubation über Nacht behandelt, und Die Injektion der Zellen intravenös in die gleichen tumortragenden Tiere. Das Tumorvolumen wird während des gesamten Experiments gemessen. Diese Zahl wurde ab 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Die Transimmunisierung steuert das Wachstum der YUMM1.7 Melanom-Syngenögenögenögenögenöte. (A) YUMM1.7 Tumorvolumen im Laufe der Zeit für C57BL-6 Mäuse mit 1 x 10 5 YUMM1.7 Tumorzellen geimpft, und entweder sechs Tranmismentationsbehandlungen (schwarze Linie), oder sechs Kontrollbehandlungen (graue Linie). Die Daten werden über neun unabhängige Experimente, die über zwei Jahre durchgeführt werden, kumuliert. B) Daten aus einem einzigen repräsentativen Experiment YUMM1.7 transimmunizaton, wobei jede Zeile Tumorwachstum für eine einzelne Maus zeigt. (A und B) Die “PBS Control”-Mäuse wurden in allen Experimenten nach dem gleichen Zeitplan geblasen wie die Versuchstiere, erhielten aber sechs sterile PBS-Wiedereinspritzungen. Fehlerbalken stellen SEM dar, p-Werte, die für jeden Zeitpunkt berechnet werden, indem Sie den mehrfachen Vergleichstest von Sidak verwenden; * *, p = 0.0013; , p < 0.0001. Diese Zahl wurde ab 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Die Transimmetriierung erfordert Monozyten und Blutplättchen in der TI-Platte übertragenen PBMC-Fraktionen, sowie 8-MOP A-Behandlung von Antigen-aufeinander abgestimmten Tumorzellen und 8-MOP Eine Schere von PBMC. (A) YUMM1.7 Tumorvolumen im Laufe der Zeit für C57BL-6 Mäuse mit 1 * 10 5 YUMM1.7 Tumorzellen geimpft, und erhalten entweder sechs Tranmismentationsbehandlungen (feste schwarze Linien), sechs Kontrollbehandlungen (feste graue Linien), oder sechs TI-Behandlungen Wo Monozyten oder Blutplättchen vor dem Plattendurchgang (mit a-CD11b bzw.-CD41-Abbau-Kits) aus PBMC abgebaut wurden, oder die Plattenpassage weggelassen wurde (punktierte Linien). (B) Tumorvolumen im Laufe der Zeit für C57BL/6 Mäuse mit 1 x 10 5 YUMM1.7 Tumorzellen geimpft, und entweder sechs Tranmismentationsbehandlungen (feste schwarze Linien), sechs Kontrollbehandlungen (feste graue Linien), PBMC allein (gestrichelte Linie), 8- MOPA-behandelteYUMM1.7-Zellen allein, oder TI mit 8-MOP A-behandelten MC38-Tumorzellen (punktierte Linien). (C) Tumorvolumen im Laufe der Zeit für C57BL/6 Mäuse mit 1 x 10 5 YUMM1.7 Tumorzellen geimpft, und entweder sechs Transimmunisierungs-Behandlungen (feste schwarze Linien), sechs Kontrollbehandlungen (feste graue Linien), sechs TI-Behandlungen, wo PBMC wurden unmittelbar vor der Plattenpassagegleichmäßig 8-MOP A ausgesetzt, sechs TI-Behandlungen, bei denen PBMCunmittelbar nach der Plattendurchfahrt gleichmäßig 8-MOP A ausgesetzt war, oder sechs Behandlungen, bei denen TI-Zellen nach der Plattenpassage 11 mit Eine gleiche Anzahl von PBMC, die gleichmäßig 8-MOP A Bestrahlung ausgesetzt sind (gestrichelte Linien). (A, B und C) Die “PBS Control”-Mäuse wurden in allen Experimenten nach dem gleichen Zeitplan geblasen wie die Versuchstiere, erhielten aber sechs sterile PBS-Wiedereinspritzungen. Die Daten werden für repräsentative Experimente bereitgestellt. Stangen repräsentieren SEM, P-Werte, die für jeden Zeitpunkt berechnet werden, indem sie den mehrfachen Vergleichstest von Sidak verwenden; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; , p < 0.001; , p < 0.0001; NS = Unterschiede nicht signifikant. Diese Zahl wurde ab 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Das TI-Protokoll mit der TI-Kammer induziert schnell die Gleichstromreifung, das einzigartige Aktivierungsprofil und die T-Zell-Aktivierung im menschlichen PBMC, abhängig von der Plattenpassage und den Blutplättchen.A. FACS-Analyse der angezeigten Marker in CD11c+ -Zellen unter entweder frisch isolierten menschlichen PBMC (“Kontrolle”), PBMC mit dem TI-Protokoll (“TI”) behandelt, oder TI-behandelte PBMC, wo die Plattenpassage weggelassen wurde, wurden die Blutplättchen mit dem -CD41 Perlensatz vor der Plattenpassage, oder beide oben wurden durchgeführt. Daten fassen sechs unabhängige Experimente mit drei Blutspendern zusammen. Balken stellen Mittelwerte dar, während Fehlerbalken SEM-Werte für jeden Vergleich darstellen, der mit gepaarter t-test berechnet wird; *, p < 0.05; * *, p < 0.01. Die Paneele wurden ab11 modifiziert. B. plateletthaltige oder platelett-verstorbente TI-behandelte menschliche PBMC wurden über Nacht mit einem irrelevanten (SIINFEKL) Peptid oder mit langem Peptid für das kopfhaltige Plattenepitheln-assoziiertes HPV-E7-Protein miteinbezogen. Die PBMC wurden dann verwendet, um eine menschliche CD8-T-Zelllinie zu stimulieren, die speziell auf E7-Peptid reaktiv ist. Die T-Zellstimulation wurde nach 5 Tagen Kultur durch die IFNg-Produktion gemessen. (C) platelet-haltige oder platelett-verstorbente TI-behandelte menschliche PBMC wurden über Nacht mit8-MOP A-behandeltem Kopf-und Nackenquaplotz-Zellkarzinomlinie SCC61 mitversorgt, die entweder ausgedrückt werden (SCC61 HPV E6/7) oder nicht ausdrücken (SCC61 keine HPV). ) die antigenen Proteine HPV E6 und E7. Die PBMC wurden dann verwendet, um eine menschliche CD8-T-Zelllinie zu stimulieren, die speziell auf E7-Peptid reaktiv ist. Die T-Zellstimulation wurde nach 5 Tagen Kultur durch die IFNg-Produktion gemessen. (B und C) Datenvertreter experimentieren mit jeweils drei Replikaten. Balken stellen Mittelwerte dar, während Fehlerbalken SEM-Werte für jeden Vergleich darstellen, der mit dem mehrfachen Vergleichstest von Sidak berechnet wird; , p < 0.001; , p < 0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. anschreiber Parameter unbehandelt ECP-Platte mit TI-Protokoll TI-Platte mit TI-Protokoll p-Wert ECP vs TI HLA-DR -MFI 100,1 ± 42, 439,8 ± 152,5 417.7 ± 152.2 Ns CD80 -% 3,9 ± 1.1 22,3 ± 7,2 24,5 ± 7,2 Ns CD83 -MFI 0,3 ± 0,2 3.3 ± 9,7 51,4 ± 17,4 Ns CD86 -MFI 10,8 ± 1,7 103,9 ± 23,4 87,1 ± 17,6 Ns PLAUR -MFI 54,5 ± 12 721,4 ± 183,6 528,7 ± 135.5 Ns ICAM1 -MFI 12,2 ± 1,6 179,6 ± 28,5 192,5 ± 25,4 Ns ITGB5 -MFI 53,6 ± 25,7 97,1 ± 31,6 103,8 ± 32,8 Ns CCL2 (MCP-1) -% 0,6 ± 0,5 70,1 ± 6,7 55,2 ± 8,9 Ns CXCL5 -% 0,7 ± 0,4 39,1 ± 7,2 41,5 ± 4,7 Ns CXCL16 -% 0,3 ± 0,2 28,0 ± 8,8 35,3 ± 11,7 Ns CD105 (endoglin) -MFI 3,6 ± 0,3 124,3 ± 25,4 141,8 ± 33.2 Ns CD112 (Nektar 2) -MFI 10,9 ± 1,8 47,3 ± 5,2 50,9 ± 9,2 Ns CD120a (TNFR-1) -MFI 10,1 ± 2,6 2,2 ± 1,4 1,8 ± 1,1 Ns CD137L (4-1BBL) -MFI 2,9 ± 1,5 1,0 ± 0,4 1,2 ± 0,6 Ns Tabelle 1: Das TI-Protokoll mit der TI-Kammer führt schnell zu einer Gleichstromreife, die der durch das TI-Protokoll mit der klinischen ECP-Kammer induzierten entspricht. FACS-Analyse der Veränderung der angezeigten Marker von entsprechenden IgG-Kontrollen in lebenden menschlichen CD11c+-Zellen unter entweder frisch isolierten PBMC (“unbehandelt”), PBMC durch die klinische ECP-Platte nach dem TI-Protokoll (“ECP-Platte mit TI-Protokoll”) und Analysierte im Folgenden die Inkubation, oder PBMC mit dem TI-Protokoll (“TI-Platte mit Protokoll”) behandelt und analysiert folgende Übernachtungs-Inkubation. Bei Markern, wie HLA-DR, bei denen die gesamte Zellpopulation verändert wurde, werden Daten als Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) ausgedrückt. Für Marker, bei denen nur eine Teilmenge von Zellen die Marker ausdrückt, wie CCL2, wird stattdessen die Differenz in den prozentualen markerpositiven Zellen von lebenden CD11c+ PBMC dargestellt. Daten fassen sechs unabhängige Experimente mit drei Blutspendern zusammen. Die Daten für jeden Marker werden als Durchschnitts-und Altersfehler ± Standardfehler des Mittels (SEM) ausgedrückt. P-Werte für jeden Vergleich, der mit gepadigter t-Prüfung berechnet wird; NS = Unterschiede nicht signifikant. Tabelle wurde ab 11 geändert Video 1: Live-Zell-Bildgebung von Platelets und Immunzellinteraktionen innerhalb der TI-Platte.PBMC wurden wie im Protokoll 2 beschrieben und der Tranmmunisierungsplatte, wie in Abschnitt 4 beschrieben, ausgesetzt, mit Ausnahme der statischen Inkubationszeit im Schritt 4.2.3 von 1 h auf 30 min reduziert wurde. Während des TI-Protokolls wurde die TI-Platte, die in der Größe identisch ist mit einer Standard-Mikroskop-Folie, in die Dia-Haltestufe eines Fluoreszenz-Bildgebungssystems eingebaut und die darin befindlichen Zellen bei 40x Vergrößerung und bei 37 ° C während der Plattenfüllung (4.2.2 ), Platteninkubation (4.2.3) und Plattenfluss (4.3.5) Stufen. Kontinuierliche Bilder wurden aufgenommen und Filme mit der Software “Automated Scanning Routine” produziert. Die Bildunterschriften unterhalb des Videos zeigen die Stufe des Protokolls an, in dem die Zellen gefilmt werden. Pfeile und Kreise im Video mit den dazugehörigen Bildunterschriften weisen auf die Zellen und Interessensgebiete hin. Die 10 μM-Waage ist im gesamten Video in der unteren rechten Ecke vorhanden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download.)

Discussion

Das oben beschriebene, miniaturisierte Gerät und Protokoll ermöglicht zum ersten Mal eine effiziente Laboruntersuchung der ECP-Mechanismen in Maus-Experimentalsystemen und in kleinen menschlichen Blutproben. Das ist ein großer Fortschritt. So ermöglichte es uns zum Beispiel, in einem Mausmodell 11 erstmals die Wirksamkeit der Transpiration gegen feste Tumoren zu demonstrieren und damit die zukünftige Möglichkeit einer ähnlichen Anwendung in der menschlichen Onkologie zueröffnen.

Vor der Entwicklung des hier beschriebenen Tranmmunisierungsgerätes und der Methode war es unmöglich, alle Aspekte von ECP vollständig zu untersuchen. In Mausmodellen, obwohl der 8-MOP A-Aspekt der Therapie durch die Behandlung von Zellen in einer Petrischale12,20etwas repliziert werden konnte, gab es keine Fähigkeit, in die Methode der Plattenpassage zu integrieren, die sich als Bieten Sie dynamische Platteninteraktionen, die für die physiologische GleichstromaktivierungvonECP von entscheidender Bedeutung sind 14. In menschlichen Studien war die Strömungskomponente alternativ voll vorhanden, aber die Fähigkeit, bestimmte zelluläre Komponenten selektiv 8-MOP A zuentlarven oder davor zu schützen, fehlte21,22. Dadurch wurde das vollständige Verständnis des ECP-Mechanismus und dessen Optimierung von Immunität oder Toleranz verhindert. Darüber hinaus ist die Menge an Blut, die benötigt wird, um mit dem klinischen ECP-Apparat zu arbeiten, groß, was die wissenschaftliche Untersuchung behindert. Das hier erstmals beschriebene miniaturisierte ECP-Gerät und-Protokoll ermöglicht eine effiziente, vollautomatische und auszähfähige Labor-ECP-Modellierung. Darüber hinaus ermöglicht die TI-Platte die Echtzeit-Visualisierung und Überwachung von Zellinteraktionen innerhalb der Platte durch Mikroskopie.

Für den Erfolg des Protokolls sowohl in vivo als auch in ex-vivo-Systemen ist es entscheidend, dass die behandelte PBMC Monozyten enthält, die in funktionalen DCs aktiviert werden können. Damit diese Aktivierung durchgeführt werden kann, ist es auch notwendig, sicherzustellen, dass die PBMC-Fraktion eine physiologische Anzahl von gesunden, aktivierbaren Blutplättchen enthält und dass das TI-Plattendurchgangsprotokoll genau eingehalten wird. Um die neu aktivierten DCs auf eine bestimmte Reaktivität auszurichten, müssen sie mit Antigen versehen werden. Wir haben herausgefunden, dass die effizienteste Methode der Antigen-Geburt zur Anti-Krebs-Immunität über Nacht die Mitinkubation der neu aktivierten DCs mitantigen-haltigen 8-MOP A-exponierten Tumorzellen ist. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass man eine immunogene Anti-Krebs-Reaktion erzeugen kann, ohne Vorkenntnisse der Tumorantigene zu erfordern, indem man den DCs die Auswahl ermöglicht. In Fällen, in denen das Antigen bekannt ist, hatten wir jedoch bei der Verwendung von freien Peptiden als Antigene in der Ko-Inkubation einige Erfolge in Ex-vivo-Systemen. Für immunogene Anwendungen sollten die DCs selbst vor 8-MOPA-Exposition geschützt werden. Schließlich ist es in vivo-Experimenten wichtig, mit einem Tiermodell zu arbeiten, das in der Lage ist, die Immunität gegen den Tumor zu bekämpfen. Die Transimmunisierung funktioniert, indem sie aktivierte, antigen-spezifische DCs schafft, die im Körper arbeiten, um angeborene und adaptive Immunreaktionen zu initiieren. Beeinträchtigte Aktivität oder Mangel an NK, CD4 oder CD8 T-Zellen in der behandelten Maus wirddieWirksamkeit des Protokolls 5, 11 beeinflussen.

Während es sich bei dem hier beschriebenen Protokoll um einen Proof-of-Proton-Proof-Proton-Protokoll handelt, das für ein Maus-solides Syngeneiz-Tumormodell optimiert wurde, offenbart es dennoch viele Möglichkeiten. Die Mechanismen von ECP in der Onkologie werden gerade erst erläutert, und es gibt noch viel Raum für ein besseres Verständnis. Im weiteren Sinne hat die Fähigkeit, physiologisch aktivierte Maus-und menschliche DCs zu erzeugen und diese selektiv auf eine antigenspezifische Immunität zu lenken, viele potenzielle Anwendungen, die über den Krebs hinausgehen. Die Fähigkeit, das Gleiche zu tun, aber stattdessen die DCs auf antigenspezifische Toleranz auszurichten, wie es die Tolerikation von ECP selbst suggeriert, hat auch weitreichende medizinische Auswirkungen. Mit dieser Methode hoffen wir, die Werkzeuge zur Verfügung zu stellen und jedem, der sich für physiologische Gleichstromtherapien interessiert, einen produktiven Forschungsweg zu eröffnen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); NIH Cancer Center Support Grant 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); Das Schulungsstipendium des Howard Hughes Medical Institute (A. Vassall); Und die NY Cardiac Foundation (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Die teilweise Unterstützung erfolgte durch die R01 CA1960-01 bis M. Bosenberg.

Die Autoren danken Dr. Robert Tigelaar für seine Mentoring, Anleitung und experimentelle Einsicht. Wir danken unseren Kollegen vom Fraunhofer IBMT, insbesondere Dr. Thorsten Knoll, für die Entwicklung und Bereitstellung der ECP-äquivalenten TI-Kammer. Nicholas Theodosakis half freundlicherweise bei den Anfangsphasen der YUMM-Experimente. Wir danken unseren ehrenamtlichen Blutspendern, Inger Christensen und ihren professionellen Mitarbeitern im Yale ECP Treatment Center für die Hilfe bei der freiwilligen Blutbeschaffung. Dr. Wendell Yarbrough und Dr. Natalia Issaeva teilten uns freundlicherweise die Zelllinien SCC61 und SCC61-E6/7. Für die technische Unterstützung des Projekts danken wir Dr. Julia Lewis für die FACS-Protokollberatung und E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote bei Yale FACS Core. Mit Hilfe von Felix Rivera-Molina, PhD, Dept of Cell Biology und Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine, wurden Filmbilder von Zellen innerhalb der TI-Platte aufgenommen. Die Filmproduktion wurde von Andrew Osborne, Senior Video Producer, Office of Communications, Yale School of Medicine, betreut.

Materials

8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 – overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 – mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 – overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 – mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 – YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 – monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 – mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 – running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 – mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 – running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 – mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 – mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument
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Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).
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