JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Nieuw protocol voor het genereren van fysiologische immunogeen dendritische cellen

Published: May 17, 2019
doi:
10.3791/59370
, , , , , , , , , , ,
1Department of Dermatology,Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department,University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology,Yale University School of Medicine

Summary

De transimmunisatie (TI) apparaat of plaat en aanverwante protocollen zijn ontwikkeld om de belangrijkste kenmerken van extracorporele fotochemo therapie (ECP) te repliceren, in een experimentele setting, waardoor voor de productie van fysiologisch geactiveerd, tunable dendritische cellen (DCs) voor kanker immunotherapie.

Abstract

Extracorporele fotochemo therapie (ECP) is een veel gebruikte kanker immunotherapie voor cutane T cel lymfoom (CTCL), werkzaam in meer dan 350 universitaire centra wereldwijd. Hoewel de klinische werkzaamheid en het voorbeeldige veiligheidsprofiel van ECP het wijdverbreide gebruik ervan hebben gestimuleerd, is de opheldering van de onderliggende mechanismen een uitdaging gebleven, mede door het ontbreken van een laboratorium ECP-model. Om dit obstakel te overwinnen en een eenvoudig, gebruiksvriendelijk platform voor ECP-onderzoek te creëren, hebben we een verkleinde versie van het klinisch ECP leukocyten-apparaat ontwikkeld, geschikt voor gebruik met zowel Muismodellen als kleine menselijke bloedmonsters. Dit apparaat wordt genoemd de transimmunisatie (TI) kamer, of plaat. In een reeks van Landmark experimenten, de verkleinde apparaat werd gebruikt om een cellulair vaccin dat regelmatig ingeleid therapeutische anti-kanker immuniteit in verschillende syngeneic muis tumor modellen te produceren. Door het wegnemen van individuele factoren uit het experimentele systeem en het vaststellen van hun bijdrage aan de in vivo anti-tumor reactie, we vervolgens opgehelderd belangrijke mechanistische bestuurders van ECP immuniserende potentieel. Gezamenlijk, onze resultaten bleek dat de anti-tumor effecten van ECP worden geïnitieerd door dendritische cellen (DC), fysiologisch gegenereerd door middel van bloed monocyten interactie met de bloedplaatjes in de TI plaat, en geladen met antigenen van tumorcellen waarvan de apoptotic cel de dood wordt fijn betiteld door blootstelling aan de photoactivatable DNA cross-linking agent 8-methoxypsoralen en UVA licht (8-MOPa). Wanneer teruggekeerd naar de muis, dit cellulaire vaccin leidt tot specifieke en overdraagbare anti-tumor T cel immuniteit. We hebben geverifieerd dat de TI kamer ook geschikt is voor menselijke bloed verwerking, het produceren van Human DCs volledig vergelijkbaar in activatie staat en profiel aan die afkomstig zijn van de klinische ECP kamer. De hier gepresenteerde protocollen zijn bedoeld voor ECP studies in muis en man, gecontroleerde generatie van apoptotic tumorcellen met 8-MOPA, en snelle productie van fysiologische mens en muis monocyten-afgeleide DCS voor een verscheidenheid van toepassingen.

Introduction

Extracorporele fotochemo therapie (ECP) is een gevestigde immunotherapie die op grote schaal werkzaam is in de universitaire centra wereldwijd. Het gebruik ervan is gedreven door unieke selectiviteit, veiligheid en bi-directionele effectiviteit van de ECP-therapie, eigenschappen die ECP deelt met het fysiologische immuunsysteem zelf waarmee het lijkt te partner. ECP is selectief immunisatie tegen de kwaadaardige cellen in cutane T cel lymfoom (CTCL)1,2, en selectief tolerizing voor gerichte antigenen in de transplantatie, autoimmuniteit, en graft-versus-host Disease (GvHD) instellingen 3 , 4. de IMMUNOGENICITEIT van ECP wordt benadrukt door zijn afhankelijkheid van een intact CD8 T-cel COMPARTIMENT in CTCL5, terwijl specificiteit wordt weerspiegeld door de zeer gunstige negatieve reactie van ECP profiel, met geen off-target immuun onderdrukking in transplantatie of GvHD instellingen, en geen verhoogde opportunistische infectie gevoeligheid in CTCL, waar niet-pathogene T-cel klonen kan mogelijk worden verloren, samen met de kwaadaardige T-cellen.

Gezien het klinisch belang van ECP, de hoop dat een beter begrip van de mechanismen kan het therapeutische bereik van ECP uit te breiden tot een breder spectrum van kanker en immunologische stoornissen heeft gestimuleerd internationale belangstelling. Twee nationaal gesanctioneerde workshops, een nationale instituten van gezondheid (NIH) State-of-the-Science symposium6 en een American Society voor aferese Consensusconferentie7, werden uitgevoerd en gerapporteerd, met als doel het versnellen van de identificatie van de belangrijkste cellulaire contribuanten aan de antikanker-en tolerogenic effecten van ECP.

Ondanks talrijke gepubliceerde rapporten die het mechanisme van ECP trachten aan te pakken, hebben twee primaire obstakels tot op heden de wetenschappelijke vooruitgang belemmerd. Ten eerste is het onderzoek naar de ECP-mechanismen in de experimentele laboratorium instelling beperkt door het ontbreken van een miniatuur ECP-apparaat dat de cellulaire en in vivo effecten van ECP volledig weerspiegelt en van toepassing is op diermodellen. In de tweede plaats is een grondige laboratoriumanalyse van ECP-monsters in de klinische setting beperkt door de beperkte beschikbaarheid van ECP-verwerkte patiënten-immune cellen, die toegang tot behandelcentra vereisen, en zijn bovendien onderworpen aan de timing van de patiënt Infusies, en de ethische behoefte aan compromisloze sets van de patiënt-reinfused leukocyten.

Om de obstakels op te lossen die de voortgang van het ECP-onderzoek belemmeren, hebben we een miniatuur ECP-apparaat ontwikkeld dat de belangrijkste elementen van de therapie het dichtst zou nabootsen. Standaard ECP-behandeling impliceert de passage van de leukapheresis-verrijkte leukocyten van een patiënt door middel van een 1 mm dik, ultraviolet een licht (UVA)-transparant, plastic plaat6,8. In de plaat, de leukocyten zijn blootgesteld aan 8-methoxypsoralen (8-MOP), een foto-activatable agent die op UVA blootstelling wordt tijdelijk omgezet in een reactieve vorm (8-MOPa), in staat van DNA-cross-linking via haar bivalente binding aan pyrimidine bases op de bundels van DNA van de zuster9,10. Verwerkt, 8-MOPA-behandelde leukocyten worden verzameld en intraveneus teruggestuurd naar de patiënt.

Sinds ECP zelf is een bi-directionele therapie, immuniserende in kanker en tolerizing in transplantatie, autoimmuniteit en GvHD instellingen, ter verduidelijking hebben we de naam model ECP immunisatie mode “transimmunisatie”, en de tolerogenic mode “transtolerization”. We hebben eerst gericht op de transimmunisatie modaliteit. Onze onlangs gemelde miniatuur schaalbare muis-naar-man ECP-apparaat, de transimmunisatie (TI) kamer of plaat, en het overeenkomstige protocol, reproduceren zowel de cellulaire en in vivo effecten van de menselijke ECP-apparaat in een kanker setting11.

Met het oog op de transvaccinatie in vivo model zo klinisch relevant mogelijk te maken, hebben we de immunotherapie gestart na onderhuidse geïnjecteerd syngeneic muis tumoren werd voelbaar, dus het testen van het protocol de werkzaamheid in gevestigde kanker. Evenzo aan ECP in CTCL, het proof-of-principe transimmunisatie protocol in de YUMM 1.7 model van melanoom maakt gebruik van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) van tumor-dragende dieren. De cellen worden doorgegeven door de TI plaat onder stroom. Terwijl 8-MOPeen behandeling van cellen in de miniatuur kamer is mogelijk, is het beter om afzonderlijk te voeren, om ervoor te zorgen dat alleen de gewenste cel type wordt blootgesteld aan 8-MOPA. Eerdere studies geven aan dat het tolerogenic effect van ECP wordt bemiddeld door 8-MOPa-gewonde antigeen-presenterende cellen12, terwijl de immuniserende werking vereist 8-MOPeen blessure van target tumorcellen11. In de transvaccinatie protocol ofwel de tumorcellen, of het immuunsysteem cellen, kan selectief worden blootgesteld aan 8-MOPA als nodig is. Sinds het maximaliseren van de tijd van contact tussen 8-MOP A-gewonde tumorcellen en ECP-geïnduceerde dendritische cellen (DC) is aangetoond dateensignificante verbetering van de immunotherapeutische capaciteit van de klinische ECP13, we opgenomen een overnachting Co-incubatie stap in ons protocol. Na nachtelijke incubatie, worden de behandelde cellen teruggegeven aan het tumor-dragend dier.

Dit systeem betrouwbare verminderde tumorgroei en in werking gestelde specifieke anti-tumor immuniteit in muizen met gevestigde syngeneic tumors11, en liet ons toe om het mechanisme van de klinische anti-tumor doeltreffendheid van ECP te ontleden. In verschillende studies hebben we aangetoond dat de ECP-immuniteit wordt geïnitieerd via ex vivo plaatjes activering in de TI plaat14,15. Geactiveerde bloedplaatjes signalering vervolgens de monocyten-to-dendritische cel rijping14, wat leidt tot de productie van fysiologische DCS. De nieuw gevormde monocyten-afgeleide DCs zijn in staat om cross-huidige interne antigenen van 8-MOPA-beschadigde tumorcellen te activeren antigeen-specifieke T-cel reacties16. Zoals eerder voorgesteld12,17, echter, 8-MOPa-geïnduceerde schade van de opkomende DCS zelf kan Counter-Act of zelfs achteruit de anti-tumor effect11, het verstrekken van een mechanistische link naar ECP tolerantie.

De TI plaat is ook gebruikt voor de productie van fysiologisch geactiveerde DCs van Human PBMC. Net als bij de muis studies, zijn menselijke TI-afgeleide DCs afhankelijk van de plaat-passage in de aanwezigheid van bloedplaatjes voor hun generatie, lijken fenotypisch identiek aan deze geproduceerd in de klinische ECP plaat, en zijn in staat om efficiënt te verwerken en het cross-presenteren menselijke tumorantigenen voor activering van menselijke T-cellen11,16.

Bij het bloot krijgen van het mechanisme van ECP immunotherapie, hebben we daarom ontdekt een methode voor het snel genereren van fysiologische muis en menselijke dendritische cellen van de gewenste antigeen specificiteit, die functioneel kan worden gemoduleerd. De innovatieve TI-apparaat en protocol hebben een aanzienlijk potentieel belang op het gebied van ECP onderzoek en therapie en kanker immunotherapie meer in het algemeen, en in elk ander gebied met belangstelling voor fysiologische, functionele dendritische cellen in zowel de immuniserende of de tolerizing modaliteit. Wij hopen dat deze publicatie de nodige instrumenten zal bieden aan degenen die belangstelling hebben voor dergelijke onderzoeksgebieden.

Protocol

Alle muis methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and use Comite (DEC) van de Yale University, in overleg met de nationale instituten van Animal Healthcare Guidelines. Alle menselijke studies werden uitgevoerd met bloed geschonken door gezonde vrijwilligers, met schriftelijke geïnformeerde toestemming. De menselijke bloed studies werden uitgevoerd overeenkomstig erkende ethische richtlijnen (b.v., verklaring van Helsinki, CIOMS, het rapport van Belmont, de V.S. gemeenschappelijke regel), en werden goedgekeurd door Yale menselijke Onderzoekraad onder protocol nummer 0301023636. Opmerking: Het volgende is het protocol beschrijft transimmunisatie voor anti-tumortherapie van de muis syngeneic tumoren. 1. Syngeneic YUMM 1.7 de inplanting van de tumor Volg gevestigde protocollen te implanteren syngeneic tumoren in de flanken van muizen, zoals passend bij de tumor cel lijn van belang.Opmerking: Het protocol hieronder beschrijft de YUMM 1.7 C57BL/6 muis melanoom tumor model. YUMM 1.7 melanoomcellen werden vriendelijk verzorgd door Dr. Bosenberg, Yale18. Ontdooi een bevroren hoeveelheid cellen en gebruik de cellen na een cel passage. De cultuur vers-ontdooide YUMM 1.7 cellen in Dulbecco van de gemodificeerde adelaar het voedende mengsel F-12 middel (DMEM/F12), aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale boviene serum (FBS), 1% penicilline/streptomycine, en 1% niet-essentiële aminozuren, onder standaard de cultuurvoorwaarden van het weefsel (37 °C, 5% CO2). Verzamel YUMM 1,7 cellen op 60 \ u201270% samenvloeiing door het toevoegen van voldoende trypsine-EDTA om de bodem van de cel kweek plaat of kolf (bijv. 4 mL voor een T75 kolf) te dekken. Rust de cel cultuur schepen bij kamertemperatuur voor 3 \ u20124 min, zachtjes te tikken op de bodem of de zijkanten van het schip af en toe te helpen losmaken van de cellen. Voeg 1 mL foetale boviene serum (FBS) toe per 4 mL trypsine-ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) om de reactie te stoppen zodra de meeste cellen zijn losgemaakt. Verzamel de cellen door in een conische buis van 15 mL te pipetteren. Spoel de kolf met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg de spoeling toe aan dezelfde inzamelings buis. Vul de tube tot 15 mL met PBS. Neem een kleine hoeveelheid en Tel de cellen. Spin down voor 10 min bij 250 x g in een standaard weefselkweek centrifuge om de tumorcellen te verzamelen. Hersuspendeer YUMM 1.7 cellen in PBS bij dichtheid van 1 x 106 cellen/ml. Injecteren 1 x 105 yumm 1.7 tumorcellen onderhuids in 100 l van PBS in de rechter flanken van de ontvanger 4 tot 6-week-oude wild type mannelijke C57BL/6J muizen, verdoofd volgens de institutionele richtlijnen (bijv. 3 \ u20125% Isofluraan inhalatie gas, anesthesie bevestigd door gebrek aan achterste poot pinch reflex). Monitor tumor volume via bi-wekelijkse metingen van loodrecht tumor diameters en hoogte met behulp van een remklauw. Bereken YUMM 1.7 (het volume van de tumor als tumor lengte x breedte x hoogte)/2. Initiëren transvaccinatie therapie wanneer tumoren worden gewoon tastbaar; voor YUMM 1.7 tumoren, dit is meestal dag 7 \ u201210 post tumor implantatie. 2. verzameling van perifere bloed mononucleaire cellen voor transimmunisatie Verzamel 100 \ u2012150 l van bloed van elke tumor-dragende muis via Wang bloeden. Als bloed wordt verzameld, zwembad bloed van elke muis behandelingsgroep (elke 5 experimentele muizen + 5 controle muizen) in een enkele 15 mL buis met 5.000 U/mL heparine. Gebruik 10 l van 10% heparine per 100 l bloed ingezameld.Opmerking: Meng de buis vaak tijdens het verzamelen om bloedstolling te voorkomen. Terwijl de controle tumor-dragende muizen kunnen worden afgetapt op hetzelfde moment als de experimentele muizen, om gelijke voorwaarden te waarborgen met de behandeling groep, de “controle” bloed kan ofwel worden weggegooid, of in combinatie met het bloed van de behandeling groep om extra te bieden experimentele PBMC voor de behandelingsgroep, naar goeddunken van de onderzoekers. Set up 1 15 mL tube met 4 mL lymfocyten isolatie medium (Zie de tabel van materialen) per 5 \ u201210 muizen Bled. Langzaam laag bloed (verzameld uit tumor-dragende muizen) op de top van het medium. Draai de cellen voor 20 min bij 1000 \ u20121, 500 x g om de PBMC van rode bloedcellen te scheiden. Aan het einde van de centrifuge, het verzamelen van de bovenste plasma laag, waardoor ~ 0,5 mL nog boven de Buffy coat, en op te slaan op 4 °C voor later gebruik (stap 7,1). Verzamel de Buffy coat Layer in een schone 15 mL buis, vul met PBS tot 15 mL, en draai voor 10 min bij 250 x g in een standaard weefselkweek centrifuge om de PBMC te verzamelen. Zorgvuldig Pipet uit de bovendrijvende, en de pellet opnieuw op te schorten door flicking de buis. Niet decanteren, als de pellet is zacht en kan worden verloren. Voeg 2 mL ACK rode bloedcel lysis buffer (Zie de tabel van de materialen) aan de buis om eventuele resterende rode bloedcellen te verwijderen uit de PBMC. Incubeer op ijs voor 10 min. Vul de buis met PBS tot 15 mL, en spin-down voor 10 min bij 250 x g in een standaard weefselkweek centrifuge om de PBMC te verzamelen. Zorgvuldig Pipet uit de bovendrijvende, en de pellet opnieuw op te schorten door flicking. Niet decanteren, als de pellet is zacht en kan worden verloren.Opmerking: Bij deze stap kan de gezuiverde PBMC worden aangepast als het beste past bij het experiment. De verschillende PBMC componenten (bloedplaatjes, monocyten, andere typen immuun cellen) kunnen worden uitgeput of geïsoleerd van de PBMC als nodig is. Ook PBMC zelf kan worden blootgesteld aan 8-MOPA, hetzij vóór of na sectie 4 (voor of na de plaat passage-na sectie 2 of vóór sectie 5), door het volgen van het protocol stappen 3.3 \ u 20123.8 en vervanging van PBMC voor yumm 1.7 cellen. Dit zal afkappen van de immunogeen capaciteit van de behandeling, en in plaats daarvan te bevorderen immuunsysteem tolerantie. Voor elke behandelgroep (elke 5 experimentele muizen + 5 controle muizen), hersuspendeer de PBMC pellet in 300 l FBS. 3.8-MOP/UVA behandeling van tumor cellen Cultuur en verzamel YUMM 1.7 tumorcellen zoals beschreven in stappen 1.2 – 1.3 om een 8-MOPA-Exposed tumor Cell antigen bron voor te bereiden. Bereid 2,5 x 106 yumm 1.7 tumorcellen per behandeling groep van 5 muizen. Voor elke behandelgroep, hersuspendeer de tumor Cell pellet in FBS op 2,5 x 106 cellen/300 l (~ 8,33 x 106 cellen/ml). Met weefselkweek kap lichten uit, voeg 8-MOP (Zie de tabel van materialen) aan de yumm 1.7 tumor cel schorsing voor een laatste 8-MOP concentratie van 100 ng/ml.Let op: 8-MOP is een photoactivatable DNA-beschadigende agent en kankerverwekkend. Wees voorzichtig bij het hanteren en doseren, Vermijd contact met de blootgestelde huid, en gooi het op de juiste wijze. Meng de cellen goed, wikkel de cel container in tin folie, en incubeer voor 20 min bij 37 °C. Pre-Coat een 12-well tissue kweek plaat door het vullen van een goed voor elke behandeling groep van 5 muizen (2,5 x 106 yumm 1.7 tumorcellen) met 1 ml FBS, en koelkast gevulde plaat voor 20 min bij 4 °C. Schakel de UVA-lichtbron in om het voor te warmen.Let op: UVA-licht is een kankerverwekkende stof. Bij het werken met UVA lichtbronnen werken snel en zorgvuldig, beschermen de huid tegen blootstelling, en het gebruik van gezicht schilden of veiligheidsbril om gezicht en ogen te beschermen. Na 20 min, verplaats de gekoelde 12-well plaat (stap 3,5) om de weefselkweek kap, verwijder FBS uit Wells, en voeg 300 µ L (2,5 x 106 cellen/goed) MOP-blootgestelde tumorcellen (vanaf stap 3,4) per put. Stel de cel-bevattende plaat bloot aan de voorverwarmde UVA-lichtbron voor totale bestraling van 4 J/cm2.Opmerking: De 8-MOP concentratie en UVA-dosis hier beschreven zijn gekalibreerd voor de YUMM 1.7 tumor cel lijn. Een titratie van 8-MOP/UVA dosis, voldoende om te veroorzaken 100% tumor celdood binnen 1 week na de blootstelling, moet worden uitgevoerd voor elke experimentele tumor cel lijn, om effectieve doden dosis te bepalen. Dit is van cruciaal belang voor de muis in vivo TI-experimenten, omdat de cellen worden geïnjecteerd retro-orbitaal (stap 6,1) en dus alle onbeschadigde tumorcellen kunnen anders vorm Eye tumoren in het behandelde dier. Als leidraad, 4 \ u20128 J/cm2 van UVA, 100 \ u2012200 ng/ml 8-MOP, is de typische effectieve bereik voor de meeste tumorcellen lijnen. Verzamel 8-MOPA-behandelde tumorcellen van elk goed, wervelende de plaat en pipetten zorgvuldig om volledige cel herstel te garanderen. 4. TI plaat passage van cellen Combineer voor elke behandelgroep van 5 muizen in één 1,5 mL conische buis 300 l van de juiste PBMC (vanaf stap 2,11) en 300 l van 8-MOPa-behandelde tumorcellen (vanaf stap 3,9). Meng de cellen. Gebruik een 10 mL spuit om de “entree” en “Exit” sets van TI tubing te vullen (Zie deLijst van materialen) met FBS. Open de slangklemmen om de buizen te vullen, en sluit klemmen zodra de buizen worden gevuld alvorens de spuit te ontkoppelen, om FBS binnen het buizenstelsel te behouden. Gebruik een P1000 pipet om de PBMC en tumor Cell mix (vanaf stap 4,1) toe te voegen aan de TI plaat (Zie de tabel van de materialen). Houd de plaat op een 45° hoek, plaats de pipet Tip stevig in de TI plaat inname, en vul de plaat langzaam, het vermijden van bubbels. Verwijder het pipet uiteinde van de inname voordat u de pipet zuiger loslaat. De plaat houdt 450 l; Breng de resterende cellen terug naar de conische buis van 1,5 mL. Incubeer de FBS-gevulde slang, de cel-gevulde TI plaat, en de 1,5 mL kegelvormige buis met de resterende cellen in de weefselkweek incubator bij 37 °C voor 1 uur. Na incubatie, leeg de TI slang door de zwaartekracht, het vrijgeven van de klemmen. Gebruik een P1000 pipet om cellen te verwijderen uit de TI plaat door het invoegen van de pipet tip met de zuiger ingedrukt in de plaat poort. Houd de plaat op een 45° hoek en vul de P1000 pipet tip. Plaats de cellen terug in hun originele 1,5 mL conische buis. Voor het uitvoeren van de TI plaat, sluit de uitgang buis op de plaat en beveilig de TI plaat in de plaat draaiend systeem. Met behulp van een 1 mL spuit, het opstellen van de 600 l van PBMC en tumor Cell mix van de 1,5 mL kegelvormige buis, te ontdoen van alle bubbels in de spuit, bevestig de spuit aan de ingang buis met de klem open en langzaam te vullen totdat vloeistof bereikt het einde van de slang. Bevestig het vrije uiteinde van de ingangs buis aan de TI plaat en blijf voorzichtig het resterende volume laden. Sluit de ingangs klem. Maak de 1 mL spuit los en sluit de ingangs slang aan op de spuitpomp. Beveilig de uitgangs slang op een schone 1,5 mL conische buis voor de verzameling van cellen. Pas het debiet van de spuitpomp aan op 0,09 mL/min, maar start de pomp nog niet. Kantel de TI plaat ~ 30° naar de spuitpomp zijde, met behulp van een TI plaat draaiend platform of andere middelen (bijv. een klein plat object onder het ene uiteinde van de plaat). Laat de klem op de ingangs buis voorzichtig los. Start de spuitpomp, zorgvuldig observeren hoe de TI plaat vult, en flick buis of plaat als nodig mocht elke luchtbellen belemmeren de stroom. Zodra de TI plaat is volledig gevuld, kantelen ~ 30° in de tegenovergestelde richting als het leeg is. Wanneer alle cellen en vloeistof zijn in de 1,5 mL kegelvormige collectie buis, stop de pomp. Om de TI plaat te wassen, koppelt u de ingangs slang los van de spuitpomp, sluit u aan op een 1 mL spuit gevuld met 600 l FBS en volgt u de procedure voor stappen 4.8 \ u 20124.9. Stel de stroomsnelheid van de spuitpomp in op 0,49 mL/min, laat de ingangs klem los en voer de TI-plaat uit zoals beschreven in de stappen 4.12 \ u 20124.13, het verzamelen van de Wash in dezelfde 1,5 mL conische buis. Veeg of tik de TI plaat voorzichtig de hele tijd, om te helpen bij het losmaken en eluting alle aanhangende cellen. Draai de collectie 1,5 mL kegel buis in de Benchtop microfuge bij 250 x g voor 8 min. Gooi de bovendrijvende. 5. voorbereiding van autologe Mouse serum voor overnight Culture medium Verzamel bloed van 10 \ u201212 week oud C57BL/6J muizen door een institutioneel goedgekeurde methode (bijv. ogen bloeden, staart ader bloeden, Wang bloeden, of Terminal bloeden-out door cardiale punctie), zonder antistollingsmiddelen. Schatting het verzamelen van 1 mL bloed voor elke 300 l van het serum nodig.Opmerking: Men zou nodig hebben 300 l van serum voor elke behandeling groep van 5 muizen in het experiment. Laat bloed te stollen ‘s nachts bij 4 ° c. Spin vaststelling van de gestolde bloed op 3.000 x g voor 15 min. zorgvuldig verzamelen van de top serum-bevattende laagOpmerking: Serum kan onmiddellijk worden gebruikt om de nachtelijke cel incubatiemedium (stap 6,1), of bewaard voor toekomstige experimenten te maken. Om het serum te bewaren, bevriezen in fracties bij-20 °C. 6. overnachting co-incubatie van PBMC met antigeen Hersuspendeer de PBMC en tumor Cell pellet (stap 4,5) in 2 mL van Clear RPMI met 15% autologe Mouse serum (bereid in stap 5). Plaat in een 35 mm niet-weefsel-cultuur behandeld steriele schotel, en broeden ‘s nachts onder standaard weefselkweek omstandigheden (37 °C, 5% CO2).Opmerking: Als PBMC worden gebruikt met een niet-cellulair antigeen (peptide, nanodeeltjes, eiwitten, enz.), laat sectie 3 van het Protocol, en ga van sectie 2 rechtstreeks naar sectie 4, het toevoegen van het gewenste antigeen aan de TI plaat-doorgegeven PBMC voor ‘s nachts co-incubatie hier in stap 6,1. Op de volgende dag, voorzichtig los alle aanhangende cellen van de onderkant van de schotel met een tissue cultuur schraper, roterende de schotel terwijl schrapen om zelfs cel collectie te waarborgen. Verzamel de cellen in een 15 mL buis. Voeg 2 mL PBS aan de schotel en herhaal de schrapen stap, het verzamelen van de cellen in dezelfde buis. Spoel de 35 mm schotel met 1 mL PBS en voeg de spoel aan dezelfde buis. Draai voor 10 min bij 250 x g in een standaard weefselcultuur centrifuge om de cellen te verzamelen. Voorzichtig Pipet uit de bovendrijvende en de pellet opnieuw op te schorten door flicking de buis. Niet decanteren, als de pellet is zacht en kan worden verloren. 7. re-injectie van TI-behandelde cellen in tumor-dragende muizen Spin down autologe plasma (bereid in stap 2,4) op 750 x g voor 15 min om sedimentdeeltjes. Hersuspendeer de Cell pellet (vanaf stap 6,4) in 600 l van autologe plasma of PBS. Injecteren cellen op 100 l per muis in de retro-orbitale plexus van de juiste verdoofd (bijvoorbeeld 3 \ u20125% Isofluraan inhaleer gas, anesthesie bevestigd door een gebrek aan achterste poot pinch reflex) tumor-Bearing experimentele muizen. Indien gewenst, re-injecteren controle tumor Bearing muizen met 100 l van autologe plasma alleen, of PBS. Voor YUMM 1.7 tumor-Bearing muizen, herhaal de behandeling (stappen 2-7.2) tweemaal per week gedurende 3 weken, voor een totaal van 6 behandelingen. Verzamelen en verwerken van de PBMC van tumor-dragende muizen wekelijks (protocol secties 2 \ u20124) op maandag en donderdag, en opnieuw infuse na nachtelijke incubatie (protocol secties 5 \ u20127) op dinsdag en vrijdag.Opmerking: Dit behandelschema werd ontwikkeld voor de specifieke groei kinetiek van YUMM 1.7 tumoren bij muizen. Het kan nodig zijn om te worden getitratied voor andere tumor systemen met een tragere of snellere groei van de tumor tarieven-respectievelijk verhoging of vermindering van het aantal behandelingen. Monitor tumor volume via bi-wekelijkse meting-bij voorkeur op het moment van therapie toediening (dinsdag en vrijdag)-van loodrecht tumor diameters en hoogte met behulp van een remklauw. Beëindig het experiment wanneer de controle tumor volumes maximale grootte bereiken die door institutionele richtlijnen en protocollen wordt toegelaten. 8. Protocol aanpassing voor de behandeling van Ssmall volumes van menselijk bloed Pas het protocol aan voor gebruik met menselijke cellen door eerst PBMC van menselijk bloed te isoleren. Gebruik heparine als anti-coagulant, met om het even welk aangewezen PBMC isolatie protocol. Zorg ervoor dat de geïsoleerde PBMC fractie een fysiologische aantal bloedplaatjes bevat, voor de beste protocol resultaten. Monitor bloedplaatjes telt pre-en post-PBMC isolatie met behulp van een standaard hematologie teller. Bij gebruik van een menselijke cellulaire antigeen bron, behandel de menselijke antigenische cellen volgens de stappen beschreven in punt 3 voor YUMM 1.7 cellen. Titratie 8-MOP en UVA doses dienovereenkomstig. Voer plaat-passage stappen uit die in sectie 4 worden beschreven, gebruikend maximaal 3 x 107 PBMC per Ti plaat. Cultuur PBMC ‘s nachts met cellulaire/andere antigeen van de keuze, zoals beschreven in paragraaf 6, maar substituut 15% humaan AB serum voor autologe muis plasma voor de nachtelijke cultuurmedium in stap 6,1. Gebruik de resulterende cellen in elke gewenste assay. Bijvoorbeeld, co-cultuur met antigeen-reactieve T-cellen te observeren antigeen-specifieke T-cel reacties geïnitieerd door de TI-behandelde cellen.

Representative Results

We hebben onlangs een muis-naar-man schaalbare miniatuur ECP-apparaat, de TI plaat (Figuur 1a), en ontworpen overeenkomstige behandeling protocollen. Het apparaat en het protocol reproduceren zeer belangrijke cellulaire en in vivo eigenschappen van het immuniseren van ECP, genoemd “transimmunisatieation”. De proof-of-principe muizen transimmunisatie protocol11 (Figuur 1b) bestaat uit extracorporele Ti plaat passage van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) van tumor-Bearing muizen samen met apoptotic 8-MOPA– blootgesteld tumorcellen. Met name de TI kamer is transparant en kleinbedrijf overeenkomen met de standaard microscopie dia-formaat, waardoor eenvoudige visualisatie van de cel interacties binnen de TI plaat op elk punt van het Protocol (Video 1). De TI-Plate-activated immune cellen worden uitgebroed ‘s nachts met de 8-MOPA-Exposed apoptotic tumorcellen, het vergemakkelijken van de tumor cel opname, verwerking en overdracht van tumor antigenen naar de DCS. Op de volgende dag, de co-incubatie cel mengsel wordt teruggegeven in de bloedstroom van de tumor-dragende dier. Controledieren ondergaan identieke bloedafname procedures, te normaliseren voor eventuele effecten van lymphodepletion op de tumorgroei, maar in plaats daarvan ontvangen PBS re-infusies. Tumor groei in alle dieren wordt gecontroleerd gedurende het experiment. In studies met behulp van de YUMM 1.7 syngeneic muizen melanoom model18, de transvaccinatie protocol werd twee keer per week herhaald over drie weken, voor een totaal van zes behandelingen in elk dier (Figuur 1b). De therapie bleek goed verdragen in alle dieren behandeld (> 100), en consequent bleek vermindering van YUMM 1.7 tumorgroei in behandelde versus controledieren, zoals waargenomen in 9 onafhankelijke experimenten uitgevoerd over 2 jaar (Figuur 2a, B). De resultaten tonen cumulatieve tumorgroei gegevens in transimmunisatie-behandeld en controledieren over alle uitgevoerde experimenten (Figuur 2a), evenals representatieve tumorgroei bochten voor individuele dieren binnen een experiment, om een gevoel te geven van variabiliteit in het systeem (Figuur 2b). We vonden dat het succes van het protocol is kritisch afhankelijk van de aanwezigheid van monocyten in de behandelde PBMC, de aanwezigheid van bloedplaatjes in de PBMC Fractie, en de TI plaat passage stap. Wanneer de plaat passage wordt weggelaten, of wanneer de bloedplaatjes of monocyten zijn uitgeput van de PBMC Fractie, wordt het therapeutisch effect niet meer waargenomen (Figuur 3a). De behandeling vereist ook de aanwezigheid van apoptotic tumorcellen. Het is ondoeltreffend in de afwezigheid van of de immune cellen of een antigeen bron, of in aanwezigheid van niet gecompenseerd antigeen, bijvoorbeeld wanneer de muizen die YUMM 1.7 tumors dragen met MC38 dubbelpunt carcinoom cellen worden behandeld (Figuur 3b). Voor een immuniserende uitkomst is het ook van cruciaal belang om te voorkomen dat PBMC blootstelling aan 8-MOPA. 8-MOPa-Exposed PBMC niet alleen intrekken, of misschien zelfs achteruit, anti-tumor immuniteit (figuur 3c), maar ook remmen het immuniserende potentieel van niet-blootgestelde cellen, zoals in het experiment waar een gelijk aantal 8-MOPA-Exposed en 8-MOP A-Protected PBMC werd gebruikt zonder waarneembaar anti-tumor effect (figuur 3c). Met de menselijke PBMC, de TI kamer en de transimmunisatie protocol leiden tot een succesvolle monocyten activering in DC, niet te onderscheiden door de cel oppervlak en intracellulaire activering markers van die bereikt door de klinische ECP plaat (tabel 1). Zoals in de muis studies, DC activatie (figuur 4a) en het vermogen van transimmunisatie-generated DCS te verwerken en aanwezig antigeen (figuur 4b,C) kritisch afhankelijk van de aanwezigheid van bloedplaatjes in de PBMC, en op TI plaat passage. De transimmunisatie-activated Human DCs kan effectief proces en cross-present ofwel peptide antigenen (figuur 4b), of antigenen van hele 8-MOPA-blootgestelde menselijke tumorcellen, te activeren menselijke antigeen-specifieke T-cel lijnen in in vitro assays (figuur 4c), in een TI en bloedplaatjes-afhankelijke wijze (figuur 4b, C). Figuur 1: transimmunisatie (TI) kamer en protocol schema’s. (A) schema en specificaties van de transimmunisatie behandeling kamer (TI plaat). (B) schematische beschrijving van transimmunisatie behandeling experimentele workflow. Kort, worden de dieren onderhuids ingeënt (s.c.) met syngeneic tumorcellen; dieren met tastbare tumoren worden twee keer per week behandeld door het bloed te trekken, isolatie van PBMC van bloed, PBMC stroom passage door de autologebloed plaatjes gecoat TI plaat in de aanwezigheid van 8-MOP/UVA behandelde tumorcellen, PBMC en tumor cel co-incubatie ‘s nachts, en Re-injectie van de cellen intraveneus in de zelfde tumor-dragende dieren. Tumor volume wordt gemeten gedurende het experiment. Dit cijfer is gewijzigd van11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: transimmunisatie controles groei van yumm 1,7 melanoom syngeneic tumoren. (A) yumm 1,7 tumor volume in de tijd uitgezet voor C57BL/6 muizen geënt met 1 x 105 yumm 1,7 tumorcellen, en het ontvangen van ofwel zes transimmunisatie behandelingen (zwarte lijn), of zes controle behandelingen (grijze lijn). Gegevens zijn cumulatief meer dan negen onafhankelijke experimenten uitgevoerd over twee jaar. (B) gegevens van één vertegenwoordiger yumm 1.7 transimmunizaton experiment, met elke lijn die de tumorgroei voor een individuele muis toont. (A en B) “PBS Control” muizen in alle experimenten werden afgetapt op hetzelfde schema als de experimentele dieren, maar ontving zes steriele PBS re-infusies. Foutbalken vertegenwoordigen SEM, p-waarden berekend voor elke tijdpunt met behulp van meerdere vergelijkingen Monica test; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Dit cijfer is gewijzigd van11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: transimmunisering vereist monocyten en bloedplaatjes in TI plaat-doorgegeven PBMC Fractie, evenals 8-MOPeen behandeling van antigeen-matched tumorcellen en 8-MOPeen sparen van PBMC. (A) yumm 1,7 tumor volume in de tijd uitgezet voor C57BL/6 muizen geënt met 1 * 105 yumm 1.7 tumorcellen, en het ontvangen van ofwel zes transimmunisatie behandelingen (Solid Black Lines), zes controle behandelingen (Solid Gray Lines), of zes Ti behandelingen waar monocyten of bloedplaatjes waren uitgeput van PBMC voorafgaand aan plaat passage stap (met behulp van a-CD11b en a-CD41 uitputting kits, respectievelijk), of plaat passage werd weggelaten (stippellijnen). (B) tumor volume in de tijd uitgezet voor C57BL/6 muizen geënt met 1 x 105 yumm 1.7 tumor cellen, en het ontvangen van ofwel zes transimmunisatie behandelingen (Solid Black Lines), zes controle behandelingen (Solid Gray Lines), PBMC alleen (stippellijn), 8- MOPa-behandelde yumm 1.7 cellen alleen, of ti met behulp van 8-MOPa-behandelde MC38 tumorcellen (stippellijnen). (C) tumor volume in de tijd uitgezet voor C57BL/6 muizen geënt met 1 x 105 yumm 1.7 tumorcellen, en het ontvangen van ofwel zes transimmunisatie behandelingen (Solid Black Lines), zes controle behandelingen (Solid Gray Lines), zes Ti behandelingen waar PBMC werden gelijkmatig blootgesteld aan 8-MOP a onmiddellijk vóórde plaat passage, zes Ti behandelingen waar PBMC werden gelijkmatig blootgesteld aan 8-MOP a onmiddellijk nade plaat passage, of zes behandelingen waar Ti cellen na plaat passage werden gemengd 1:1 met een gelijk aantal PBMC die gelijkmatig zijn blootgesteld aan 8-MOPeen bestraling (stippellijnen). (A, B en C) “PBS Control” muizen in alle experimenten werden afgetapt op hetzelfde schema als de experimentele dieren, maar ontving zes steriele PBS re-infusies. Er worden gegevens verstrekt voor representatieve experimenten. De staven vertegenwoordigen SEM, P-waarden die voor elk tijdpunt worden berekend gebruikend de veelvoudige vergelijkingen test van Monica; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = verschillen niet significant. Dit cijfer is gewijzigd van11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: het Protocol van TI met de kamer van TI veroorzaakt snel gelijkstroom rijping, uniek activerings profiel, en T cel activerende capaciteit in menselijke PBMC, afhankelijk van plaat passage en bloedplaatjes.A. FACS analyse van de aangegeven merkers in CD11c+ cellen onder hetzij vers geïsoleerde menselijke PBMC (“controle”), PBMC behandeld met het Ti-Protocol (“Ti”), of Ti-behandelde PBMC waar plaat passage werd weggelaten, bloedplaatjes waren uitgeput met behulp van de a-CD41 Bead Kit voorafgaand aan de plaat passage, of beide van de bovenstaande werden uitgevoerd. De gegevens vatten zes onafhankelijke experimenten met drie bloeddonors samen. De staven vertegenwoordigen gemiddelde waarden, terwijl de fouten staven SEM. P-waarden voor elke vergelijking vertegenwoordigen die gebruikend gepaarde t-test wordt berekend; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Panelen zijn gewijzigd van11. B. bloedplaatjes-bevattende of bloedplaatjes-uitgeput Ti-behandelde menselijke PBMC werden mede-uitgebroed ‘s nachts met een IRRELEVANT (SIINFEKL) peptide, of met lange peptide voorhoofd-en-hals plaveiselcel cel carcinoom-geassocieerde HPV E7 eiwit. De PBMC werden vervolgens gebruikt om een menselijke CD8 T-cel lijn specifiek reactief te stimuleren om E7 peptide. T Cell stimulatie werd gemeten door IFNg productie na 5 dagen van cultuur. Cbloedplaatjes of bloedplaatjes-verarmde Ti-behandelde menselijke PBMC werden ‘s nachts samen met 8-MOPA-behandeld hoofd-en-nek plaveiselcel cel carcinoom cel lijn SCC61, hetzij uitdrukken (SCC61 HPV E6/7) of niet uitdrukken (SCC61 geen HPV ) antigene HPV E6 en E7 proteïnen19. De PBMC werden vervolgens gebruikt om een menselijke CD8 T-cel lijn specifiek reactief te stimuleren om E7 peptide. T Cell stimulatie werd gemeten door IFNg productie na 5 dagen van cultuur. (B en C) Gegevens tonen representatieve experimenten met drie repliceert in elk. De staven vertegenwoordigen gemiddelde waarden, terwijl de fouten staven SEM. P-waarden voor elke vergelijking vertegenwoordigen die gebruikend de veelvoudige vergelijkingen test van Monica wordt berekend; , p < 0,001; , p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Markering Parameter Onbehandeld ECP-plaat met TI-Protocol TI plaat met TI Protocol p-waarde ECP VS TI HLA-DR Δ MFI 100,1 ± 42,4 439,8 ± 152,5 417,7 ± 152,2 Ns CD80 Δ 3,9 ± 1,1 22,3 ± 7,2 24,5 ± 7,2 Ns CD83 Δ MFI 0,3 ± 0,2 53,3 ± 9,7 51,4 ± 17,4 Ns CD86 Δ MFI 10,8 ± 1,7 103,9 ± 23,4 87,1 ± 17,6 Ns PLAUR Δ MFI 54,5 ± 12 721,4 ± 183,6 528,7 ± 135,5 Ns ICAM1 Δ MFI 12,2 ± 1,6 179,6 ± 28,5 192,5 ± 25,4 Ns ITGB5 Δ MFI 53,6 ± 25,7 97,1 ± 31,6 103,8 ± 32,8 Ns CCL2 (MCP-1) Δ 0,6 ± 0,5 70,1 ± 6,7 55,2 ± 8,9 Ns CXCL5 Δ 0,7 ± 0,4 39,1 ± 7,2 41,5 ± 4,7 Ns CXCL16 Δ 0,3 ± 0,2 28,0 ± 8,8 35,3 ± 11,7 Ns CD105 (endoglin) Δ MFI 3,6 ± 0,3 124,3 ± 25,4 141,8 ± 33,2 Ns CD112 (nectin 2) Δ MFI 10,9 ± 1,8 47,3 ± 5,2 50,9 ± 9,2 Ns CD120a (TNFR-1) Δ MFI 10,1 ± 2,6 2,2 ± 1,4 1,8 ± 1,1 Ns CD137L (4-1BBL) Δ MFI 2,9 ± 1,5 1,0 ± 0,4 1,2 ± 0,6 Ns Tabel 1: Ti protocol met Ti kamer induceert snel DC rijping gelijk aan die veroorzaakt door Ti-protocol met de klinische ECP kamer. FACS analyse van de verandering van de aangegeven markers van overeenkomstige IgG controles in levende menselijke CD11c + cellen onder ofwel vers geïsoleerde PBMC (“onbehandeld”), PBMC doorgegeven via de klinische ECP plaat na het TI-Protocol (“ECP plaat met TI protocol”) en geanalyseerd na nachtelijke incubatie, of PBMC behandeld met de TI-Protocol (“TI plaat met protocol”) en geanalyseerd na nachtelijke incubatie. Voor markers, zoals HLA-DR, waar de hele cel populatie werd veranderd, worden de gegevens uitgedrukt als verandering in de gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI). Voor markeringen waar slechts een ondergroep van cellen de teller, zoals CCL2 uitdrukt, is het verschil in percenten teller-positieve cellen van levende CD11c + PBMC in plaats daarvan vertegenwoordigd. De gegevens vatten zes onafhankelijke experimenten met drie bloeddonors samen. De gegevens voor elke teller worden uitgedrukt als Gem-leeftijd ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). P-waarden voor elke vergelijking berekend met behulp van gepaarde t-test; NS = verschillen niet significant. Tabel is gewijzigd van11. Video 1: Live cel beeldvorming van bloedplaatjes en immune Cell interacties binnen de TI plaat.PBMC werden voorbereid zoals beschreven in Protocol sectie 2 hierboven en blootgesteld aan de transimmuniserings plaat zoals beschreven in punt 4, met uitzondering van de statische incubatietijd in stap 4.2.3 werd verlaagd van 1 uur tot 30 min. Tijdens het TI-protocol, de TI plaat, die identiek is in grootte van een standaard Microscoop dia, werd gemonteerd in de dia Holding fase van een fluorescentie Imaging systeem en de cellen binnen het werden afgebeeld op 40x vergroting en bij 37 ° c tijdens het vullen van de plaat (4.2.2 ), plaat incubatie (4.2.3), en Plate flow (4.3.5) stadia. Continue beelden werden verworven en films geproduceerd met behulp van de “geautomatiseerde Scanning routine” software. De bijschriften onder de video geven de fase van het protocol dat de cellen worden gefilmd op. Pijlen en cirkels in de video, met de bijbehorende bijschriften, wijzen op de cellen en gebieden van belang. De 10 μM schaal staaf is aanwezig in de lagere juiste hoek door de video. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

Het verkleinde apparaat en protocol hierboven beschreven voor de eerste keer zorgen voor een efficiënt laboratoriumonderzoek van de mechanismen van ECP in de muis experimentele systemen, en in kleine menselijke bloedmonsters. Dit is een grote vooruitgang; zo liet het ons toe om voor het eerst de werkzaamheid van transimmunisatie tegen vaste tumoren in een muismodel 11aan te tonen, waardoor de toekomstige mogelijkheid van een gelijkaardige toepassing in de menselijke oncologie wordt geopend.

Voorafgaand aan de ontwikkeling van de transimmunisatie apparaat en methode beschreven hier, was het onmogelijk om volledig te onderzoeken alle aspecten van ECP. In muismodellen, hoewel de 8-MOPeen aspect van de therapie enigszins zou kunnen worden gerepliceerd door het behandelen van cellen in een Petri schaaltje12,20, was er geen capaciteit om te integreren in de methode van de plaat passage, die is aangetoond dat dynamische bloedplaat interacties bieden die van cruciaal belang zijn voor de fysiologische DC-activering van ECP14. In menselijke studies, alternatief, was de stroom component volledig aanwezig, maar de capaciteit om specifieke cellulaire componenten aan 8-MOPAselectief bloot te stellen, of hen te beschermen van het, miste21,22. Dit verhinderde het volledige begrip van ECP mechanisme, en zijn optimalisering voor immuniteit of tolerantie. Bovendien is de hoeveelheid bloed die nodig is om te werken met de klinische ECP-apparaat is groot, belemmeren wetenschappelijk onderzoek. Het verkleinde ECP-apparaat en-protocol dat hier voor het eerst wordt beschreven, zorgen voor een efficiënt, volledig flexibel en tunable laboratorium ECP-modellering. Bovendien zorgt de TI plaat voor real-time visualisatie en monitoring van cel interacties binnen de plaat door microscopie.

Voor het succes van het protocol met behulp van zowel in vivo en ex vivo systemen, is het van cruciaal belang dat de behandelde PBMC bevatten monocyten die kunnen worden geactiveerd in functionele DCs. Voor deze activering om verder te gaan, is het ook noodzakelijk om ervoor te zorgen de PBMC fractie bevat een fysiologische aantal gezonde, activatable bloedplaatjes, en dat de TI plaat passage protocol wordt nauwlettend gevolgd. Om de nieuw geactiveerde DCs naar een specifieke reactiviteit te leiden, moeten ze voorzien zijn van antigeen. Wij hebben geconstateerd dat de meest efficiënte methode van antigeen levering voor anti-kanker immuniteit nachtelijke mede-incubatie van onlangs geactiveerde DCs met antigeen-bevattende 8-MOPA-blootgestelde tumorcellen is. Dit heeft het toegevoegde voordeel om een immunogeen anti-kanker reactie te kunnen creëren zonder voorafgaande kennis van de tumorantigenen te vereisen, door de DCs toe te staan om hen te selecteren. Nochtans, in gevallen waar het antigeen gekend is, hadden wij wat succes in ex vivo systemen wanneer het gebruiken van vrije peptides als antigenen in co-incubatie. Voor immunogeen toepassingen, de DCs zelf moet worden beschermd tegen 8-MOPeen blootstelling. Ten slotte, in in vivo experimenten, is het belangrijk om te werken met een diermodel dat in staat is van anti-tumor immuniteit. Transimmunisering werkt door het creëren van geactiveerde, antigeen-specifieke DCs, die werken in het lichaam om aangeboren en adaptieve immuunrespons te initiëren. Verminderde activiteit of het ontbreken van de NK-, CD4-of CD8 T-cellen in de behandelde muis zal invloed hebben op de werkzaamheid van het protocol5,11.

Hoewel het hier beschreven protocol is een proof-of-principe een die is geoptimaliseerd voor een muis solide syngeneic tumor model, maar onthult toch veel kansen. De mechanismen van ECP in de oncologie worden slechts opgehelderd en er is nog veel ruimte voor een beter begrip. Meer in het algemeen, heeft de capaciteit om fysiologisch geactiveerde muis en menselijke DCs te produceren, en om hen naar antigeen-specifieke immuniteit selectief te leiden vele potentiële toepassingen voorbij kanker. De mogelijkheid om hetzelfde te doen, maar in plaats daarvan direct de DCs naar antigeen-specifieke tolerantie, zoals wordt voorgesteld door de tolerizing werkzaamheid van ECP zelf, heeft ook een brede medische implicaties. Met deze methode, hopen we de tools te bieden en open een productieve weg van het onderzoek voor iedereen met een interesse in fysiologische DC therapieën.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Entjes, M. Girardi); NIH Kankercentrum steun toelage 3 P30 CA16359-28S1 (R. Entjes, M. Girardi); het Howard Hughes Medical Institute training Fellowship (A. vazal); en de NY cardiale Stichting (R. Entjes, A. Ventura, A. vazal, H. Ezaldein). De gedeeltelijke steun werd verstrekt door R01 CA196660-01 aan M. Bosenberg.

De auteurs zijn dankbaar Dr Robert Tigelaar voor zijn mentorschap, begeleiding, en experimentele inzicht. Wij danken onze collega’s bij Fraunhofer IBMT, met name Dr. Thorsten Knoll, voor het ontwikkelen en verstrekken van de ECP-equivalent TI kamer. Nicholas Theodosakis vriendelijk geholpen met de eerste stadia van de YUMM experimenten. Wij danken onze vrijwilliger bloeddonoren, Inger Christensen en haar professionele medewerkers van Yale ECP Treatment Center voor hulp bij vrijwillige bloed verwerving. Dr. Wendell Yarbrough en Dr. Natalia Issaeva delen met ons de SCC61 en SCC61-E6/7 Cell Lines. Voor technische bijstand op het project, wij danken Dr. Julia Lewis voor FACS protocol advies, en E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote bij Yale FACS core. Filmbeelden van cellen binnen de TI plaat werden verworven met de hulp van Felix Rivera-Molina, PhD, Dept van celbiologie en Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. Filmproductie werd begeleid door Andrew Osborne, Senior video producer, Office of Communications, Yale School of Medicine.

Materials

8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 – overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 – mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 – overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 – mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 – YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 – monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 – mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 – running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 – mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 – running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 – mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 – mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edelson, R., et al. Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results. The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).
  2. Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens. The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).
  3. Scarisbrick, J. J., et al. A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent. Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).
  4. Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. Extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).
  5. Heald, P., et al. Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).
  6. Ratcliffe, N., et al. National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis. Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).
  7. Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. American council on ECP (ACE): Why now?. Journal of Clinical Apheresis. , (2018).
  8. Edelson, R. L. Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).
  9. Gasparro, F. P., Dall’Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy. The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).
  10. Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).
  11. Ventura, A., et al. Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity. Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).
  12. Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?. Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).
  13. Girardi, M., et al. Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study. Leukemia & Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).
  14. Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).
  15. Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin. Clinical & Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).
  16. Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells. Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).
  17. Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms. Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).
  18. Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell & Melanoma Research. , (2016).
  19. Gubanova, E., et al. Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival. Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).
  20. Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes. Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).
  21. Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease. Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).
  22. Berger, C., et al. Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy. Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).

Tags

Dendritic CellsPhysiologic Dendritic Antigen-presenting CellsPhDCMonocyte-to-DC ConversionPlatelet SignalingAnti-tumor T Cell ResponsesMonocyte-to-PhDC MaturationPeripheral Blood Mononuclear CellsPBMCRed Blood Cell LysisTumor-bearing Mice

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image