Руководство по созданию весьма склонен прокатилась плитка микроскоп для расширенного поля зрения одной молекулы изображений
Summary
Подробная инструкция описано о том, как построить очень склонны прокатилась плитка (HIST) микроскопа и его использования для одной молекулы воображения.
Abstract
Одноместный молекула изображений значительно расширить наше понимание молекулярных механизмов в биологических исследованиях. Однако было сложно получить большие поля зрения, высокая контрастность изображения в толстые клеток и тканей. Здесь мы представляем очень склонны прокатилась плитка (HIST) микроскопия, который преодолевает эту проблему. Пара Цилиндрические линзы был реализован для создания удлиненные возбуждения луч, который был проверен на большой площади изображения через быстрый гальво зеркало. 4f конфигурации был использован для позиционирования оптических компонентов. Научно взаимодополняющих металло оксидных полупроводников камеры обнаружен сигнал флуоресценции и заблокировали фон из из фокус с динамической конфокальный разрезом синхронизированы с луч подметать. Мы представляем пошаговые инструкции по созданию HIST микроскоп со всеми основными компонентами.
Introduction
Одноместный молекула флуоресценции изображений играет важную роль во многих биологических исследованиях, которые показывают данное, динамика и количество биомолекул1,2,3. Однако она была сложной для изучения одного молекул внутри клетки или ткани. Хотя confocal микроскопии обеспечивает высокую секущей возможности4, это не подходит для одного молекула изображений из-за тяжелой Фотообесцвечивание возбуждения высокой интенсивности или медленной скорости визуализации. Widefield микроскопии использует более слабой освещенности, но страдает от бедных сигнала фона соотношение (SBR)5. Свет лист микроскопии, с другой стороны, может показать хороший секционирование и низкий Фотообесцвечивание6; Однако имеющиеся числовой апертуры (NA) сильно ограничены требованием ортогонально размещены цели7. Кроме того он требует специальных осветителей и образец камеры8,9.
По этим причинам весьма склонны и ламинированные оптических листа (ХИЛО) микроскопия широко используется для 3D визуализации сингл молекула10. Когда Наклонный луч встречает интерфейс раздела двух сред (стекла и воды, например), луч преломляется согласно закону Снелл. Важно отметить, что преломления луча становится тоньше, и толщина его описывается как dz = R/tan(θ), где R – диаметр Наклонный луч и θ — угол преломления передаваемого луча. Это простая реализация приводит к хорошей возможности резания. Тем не менее эта связь указывает, что тонкие освещения (то есть, высокой секущей возможности) требует небольшой R и/или большой θ. Например, когда R = 20 мкм и θ = 72 градусов, можно получить dz = 6,5 мкм. Поскольку существует практический предел для увеличения угла преломления для изображения глубоко внутри клетки и избежать полного внутреннего отражения, существует сильное сцепление освещения диаметра и толщины луча. По этой причине HILO изображений показывает сравнительно небольшой поле в зрения (FOV, существенно ограничивает ее применения в многоклеточных изображений).
Недавно мы преодолеть эту проблему путем микроскопии весьма склонен прокатилась плитка (HIST), где FOV отделяется от толщины луча в очень простой способ11. Во-первых вытянутые в одном направлении луч генерируется через пару Цилиндрические линзы. Этот луч, как плитка, производит тонкие освещения с dz ~ 4 мкм, а его ПЗ-130 x 12 мкм2. Затем плитка охватила образца с помощью вращающегося зеркала гальво. Тем временем флуоресценции изображение записывается на камеру научных взаимодополняющих металло оксидных полупроводников (sCMOS), которая фильтрует эффективно вне фокуса фон в скользящего затвора режиме, который служит перестраиваемый конфокальный щели обнаружения. Таким образом HIST микроскопии позволяет одной молекулы изображений с большей поля зрения (~ 130 x 130 мкм2) и тоньше освещение чем HILO изображений. Мы применили новые визуализации технику, чтобы обнаружить РНК стенограммы с единичного пробоотборника в клетках или в нескольких датчиков в тканях мозга мыши, который имеет значительный потенциал для изучения экспрессии генов и заболеваний. В отличие от других подходов HIST использует только один высокая числовая апертура цели без дополнительный осветитель или дистанционного обнаружения цели и полностью совместим с Перевернутый микроскопы. Эти преимущества наряду с большой угол обзора и высокий контраст будет сделать HIST микроскопии выдающийся инструмент в биологии и медицине. Мы представляем подробные инструкции относительно инструментария HIST микроскопа, и как для тестирования и калибровки его производительность, как показано ниже.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует два важных шага в настоящем Протоколе. Первый из них является надлежащее размещение L4 в шаге 3.3, обеспечивая инцидента луч проходит через центр объектива и формируется идеальный диск Эйри модель на потолке. Положение L4 определяет размещение всех других оптических компонентов, включая M5, L2, L3 и ГМ. Вторым важным шагом является процесс синхронизации. Чтобы отклонить вне фокуса фона, активных пикселов, эффективного обнаружения, ширина которого равна ширине плитки должны быть синхронизированы с луч подметать. Таким образом необходимо измерить ширину эффективного освещения пучка плитка (шаг 5.6) и параметры установить камеры соответственно в шаге 6.4.
При визуализации с очень большими ПЗ, представленный метод показывает увеличение фон с одной стороны, по сравнению с другой стороны. Это объясняется слегка изменены углы освещения позиции различных изображений. Реализация второй гальво зеркало вместо M5 снимает эту проблему, как продемонстрировал перед синхронно регулируя позицию и сканирования угол11. Вместо того, чтобы готовый ахроматические Дуплеты телецентрическим объективом сканирования будет также полезно. Однако, для визуализации области < 8,080 µm2, единый гальво подметать зеркало было достаточно. Микроскопия HIST имеет предел глубины изображения, однако, это возможность получить хороший SBR, при визуализации до ~ 15 мкм с лучом плитка 12 мкм и NA 1,45 масло погружения объектива11.
В этом протоколе мы использовали луч сжатия 8 сделать пучок плитки. Тонкие освещения может использоваться в HIST микроскопии для достижения более высоких SBR, который может быть мощным для одной молекулы тканей изображений11. Однако в данном случае, Фотообесцвечивание эффект должен быть рассмотрен интенсивность увеличения возбуждения в то время как текущий коэффициент сжатия луч показал снижение Фотообесцвечивание в 3D визуализации, по сравнению с Epi11. По сравнению с свет лист Микроскопы с двух ортогонально размещены целей, HIST микроскопии прост в реализации и совместимы с обычными образец препаратов. Расширение SBR и большой ПЗ HIST микроскопии подходит для изучения взаимодействия и динамику одного биомолекул в несколько ячеек и может быть использован далее в супер-резолюции изображений и одной молекулы отслеживания.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана обороны передовых исследовательских проектов агентства (DARPA) (HR00111720066) и Национальный фонд науки (NSF) (1805200). Мы благодарим Майкла Serge в Andor технологии за щедро кредитование sCMOS камеры.
Materials
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
| 1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
| 1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
| 1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
| 1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
| 1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
| 2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
| 2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
| 20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
| 30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
| 30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
| 3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
| 405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| 50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
| 561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
| 638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
| Beam alignment tool | custom made | ||
| BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
| Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
| Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
| Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
| Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
| Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
| Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
| Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
| Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
| long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
| Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
| Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
| Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
| Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
| Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
| Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
| N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
| NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
| Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
| Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
| Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
| Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
| Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
| Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
| RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
| Rod holder | custom made | ||
| Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
| sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
| Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
| SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
| SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
| Stage mount | custom made | ||
| threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |
References
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361, 880-887 (2018).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer. Science. 359, (2018).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).
- Wilson, T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope. Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).
- Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope. Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nature Methods. 8, 1047 (2011).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12, 641 (2015).
- Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. 3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet. Nature Communications. 9, 123 (2018).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, 159-161 (2008).
- Tang, J., Han, K. Y. Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination. Optica. 5, 1063-1069 (2018).
- Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution. Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).
- Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. Ray tracing analysis of inclined illumination techniques. Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).
