高傾斜の構築ガイド拡張ビュー フィールドの単一分子イメージング用タイル顕微鏡を掃引

1. 顕微鏡、レーザーおよび配置ツールをセットアップします。 顕微鏡を構築する前に光学系、生: オプトメカトロニクス-電子材料の表に記載されているなど、必要なすべてのコンポーネントを準備します。 2 つの部分の主に構成されて顕微鏡本体の準備: RMS スレッド ポートとピエゾ ステージ客観的ホルダー マウント アルミ ブロック (図 1A)。注: カスタムメイド顕微鏡本体は、利便性と計測12の柔軟性に使用されます。すべての市販の顕微鏡のボディは、HIST 顕微鏡に使用できます。 複数のレーザー ラインを組み合わせると、シングル モード光ファイバーにそれらを結合 インストール 405, 561, 638 nm のレーザー光に表、図 1Bに示すように、偏光ビームスプリッターとロングパス ・ ダイクロイック ミラーを介して梁を組み合わせます。すべてのレーザ光線がアライメント ツールにピンホールを通過するかどうかを確認します。パワーの調整のための半波長板を挿入します。注: 眼の保護のための安全ゴーグルを着用、ビーム ブロックを使って不要なレーザー光を吸収します。 繊維のカップリング レンズをインストール (f = 4.5 mm) とファイバー アダプター z 軸翻訳でケージ システム。 マルチモード光ファイバー (MMF、Ø 62.5 μ m) をファイバー アダプターに接続します。各レーザーのカップリング効率が 95% 以上になるまでは、ステアリングのミラーと z 翻訳の各ペアを調整します。出力ビームは、スペックル パターンと近いガウス形プロファイルを持っています。 マルチモード光ファイバーを奪う、シングル モード光ファイバー (SMF) を接続します。MMF と同様に微調整から 3 つのレーザーの結合効率を最大化します。 励起と検出パス内の梁の配置に使用される平行光源を組み立てます。このデバイスは一時的光源から成る (561 nm) SMF、色消しレンズ、ファイバー アダプターに接続されている (f = 60 mm)、アイリスと Ø1「ケージ システム (図 1C) スペーサーをチューブ。ファイバー アダプターとコリメーションようにせん断の干渉計を用いたレンズの間の距離を調整します。 梁の配置ツール (図 1D) を準備します。これ 2″迅速かつ正確な光軸調整を可能にする光学テーブルの表面からの高さでピンホールとアルミニウムの記事のペアです。 2 Ø1 から成っている二重ピンホール システムを組み立てる”両端に地面のガラスの配置ディスクと 2 つの Ø1″レンズ チューブ (1 番下は、すり割り付き) の図 1に示すように。 2. 検出パスを設定 目的を取り出し、平行光源をインストールします。テーブルの上のネジ穴、顕微鏡から出力ビームは約高さ光学テーブルに平行で整列して客観的ホルダーの下にミラー (M1) のノブを調整します。光の各コンポーネントの詳細な位置図 2を参照してください。 マルチバンド ダイクロイック ミラー (DM) を挿入し、90 度ビームを反映します。虹彩の最大サイズを使用して、ビームがクリッピングせずダイクロイック ミラーの中心を通過するかどうかを確認します。 ダイクロイック ミラーを通過漏れのビームを使用して、検出パスの配置を進めます。梁に sCMOS カメラを配置し、ビームが (M2 および M3) 2 つのミラーを使用してカメラ チップの中心を打つことを確認します。 チューブ レンズを挿入 (TL; f = 300 mm) カメラから離れて約 300 mm。 平行光源を削除し、天井のパターンが明らかにカメラによって解決されるまでチューブ レンズとカメラの間の相対距離を調整します。 マルチカラー蛍光イメージングのためチューブ レンズの前に複数のバンドパス フィルター (BF) を挿入します。 3 励起パスの設定 目的のホルダーに平行光源を再インストールします。顕微鏡から 90 度折りミラー ビーム出力をリダイレクトする (M4) を配置します。梁は梁の配置ツールのピンホールを通過するまで繰り返しダイクロイック ミラーとフォールド ミラーのノブを調整します。 平行光源をデタッチして、ビームを指して顕微鏡本体、テーブルの上にそれをインストールします。梁配置ツールとピンホールを二重システムを使用して梁を配置します。 レンズ L4 を挿入 (f = 400 mm;Ø = 2″) 光パス客観的ホルダーから約 400 mm に。対物レンズをインストールし、天井に完璧なエアリー ディスク パターンが形成されるまで光軸に沿って L4 の位置を調整します。注意: レンズを挿入すると、レンズを通るビーム位置保管すべき変更。レンズ L4 は、60 mm SM2 スレッド ケージ プレートからアタッチ/デタッチを簡単にすることができます SM2 スレッドを持っています。 目的を緩めて開いてアイリスと平行光源を再インストールします。ビジネス カードを使って顕微鏡からのビーム出力をトレースします。梁のサイズが最小の場所で L4 共役像面 (cIP) であるから約 400 mm M5 ミラーをマウントします。 ミラー M6 をインストールし、90 度ビームを反映します。梁の配置ツールで繰り返し M5 と M6 を調整します。 レンズ L3 を挿入 (f = 150 mm) M5 から約 150 mm。シェアリング干渉計を使用して、出力ビームのコリメーションを確保します。 L4 とビームを下ってトレース L3 の焦点の位置を見つけるため一時的に奪います。この時点で単軸ガルバノ ミラーを置く、共役後焦点面 (コンゴ) であります。ガルバノ ミラーに 0 ボルトを供給し、90 度ビームを反映するようにガルバノ ミラーのホルダーを回転させます。 フォールド ミラー M7 を配置します。L2 を正しく配置 (f = 100 mm) ステップ 3.6 と同様。 オブジェクト所有者から平行光源を削除します。コリメーション レンズ L1 をインストール (f = 100 mm)、光ファイバー アダプターとアイリス。シングル モード光ファイバーをアダプターに接続し、イメージング システムを介してビームを送信します。 L4 を挿入し、天井に完璧なエアリー ディスク パターンが表示されるまで、システムを微調整します。 4. 円筒レンズを設定 シリンドリカル レンズを挿入 (CL1、f = 400 mm) L1 後軸ビームが円筒のレンズに焦点を当てているかどうかを確認。 もう一つの円筒型レンズを挿入 (CL2、f = 50 mm) ビーム パスします。せん断の干渉計を使用すると、出力ビームを平行しています。注: 2 つの円筒形のレンズ間の距離は 450 mm です。出力ビームは 8 の圧縮率と天井に細長い楕円形のエアリー ディスク パターンが形成されます。 5. タイル画像のテスト 3D ゲルのサンプルを準備します。ミックス 20 nm クリムゾン ビーズ 12 rylamide:bisacrylamide (29:1)、0.2% (v/v) TEMED と 0.75 x TAE バッファー内過硫酸アンモニウム 0.2% (w/v) から成るハイドロゲル ソリューション。フロー室11を別の場所で説明されているように 50 μ L の混合液を注入します。10 分後に 3 D ゲル サンプルは、イメージングのために準備ができています。 サンプル ホルダーにサンプルを置きます。638 nm レーザーをオンにし、パワーを調整 < 1 サンプル励起用 mW。 カメラ制御ソフトウェアを実行します。カメラ取り込み設定パネルでトリガー モードで内部を選択し、ビデオを取る無料モードを実行するをクリックします。 少しカメラの中央にイメージが配置 0 ボルトをガルバノ ミラーに適用する場合、カメラの位置を調整します。 高傾斜照明を達成するために M5 ミラーの横のノブを回します。注: 照明角度の増加に伴い、ハイドロゲル イメージなる梁が薄くなるとエピのイメージよりも明確。ただし、画像はほぼ同じ位置を保持します。 タイル画像を記録します。効果的な照明幅11を計算します。たとえば、図 3は 12 μ m の効果的な照明の幅を示しています。 6. HIST イメージング ターミナル ブロックに接続されているデータ集録ボードを準備します。電線を通る P0.0 のユーザー 1 BNC コネクタを接続します。SCMOS カメラの外部トリガリング用デジタル出力としてユーザー 1 を使用します。アナログ接続 AO0 をガルバノ ミラー ドライバーに出力します。 カスタムメイド プログラム (図 4A) を使用して P0.0 から TTL パルス列を生成し、周期時間を設定 = 400 ms と t_ON = 2 さんデジタル ・ オシロ スコープでユーザー 1 BNC 端子から生成されたパルスを確認し、カメラに BNC ケーブルを接続外部トリガー ポート。注: このペーパーで使用される制御ソフトウェアはリクエストを承ります。別のカメラのフレーム レートでイメージングするときは、期間の時間が調整すべき。 カスタムメイドのプログラムを介してガルバノ ミラーを掃除を開始します。V分-500 mV と V最大500 調整における FOV のイメージングのための mV。この操作は、[3 D ゲル サンプルまだ示す高いバック グラウンド Epi 照明のように注意してください。 カメラの取り込み設定を変更します。 [外部トリガー モード上下(シーケンシャル) LightScan プラス」ドロップ ダウン メニューで図 4Bに示すようします。注: この設定でカメラがない画像を取るトリガー信号が有効でないです。 ウィンドウの高さとラインの露光時間制御のスキャン速度コントロールをクリックし、 180 行と28 ms、それぞれに値を設定します。メモ: タイルの幅 (Weff) が 180 行 (12 μ m) と、1行 (T はint) の積分時間は 28 ms ライン (TD) 間の遅延時間が決まります TDと Tint/Weffを = = 2,048 x をイメージング 0.156 さん2,048 ピクセルは、集録時間の合計は TD + Tint x 2,048 = 346 ms、~2.9 fps に対応します。 若干 Vmax Vminより鮮明な画像を取得するを調整します。 3 D スタック上に、スタックとステップ サイズの番号を指定することでオーダーメイドのプログラムを使用して画像を 3D スタックを取得します。