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Immunology and Infection

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

Published: April 09, 2019
doi:
10.3791/59357
, , ,
1Department of Internal Medicine,University of New Mexico Health Science Center, 2Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

Abstract

인간의 3 차원 (3D) enteroid 또는 colonoid 문화 토 굴 기본 줄기 세포에서 파생 된는 현재 장 상피의 가장 진보 된 비보 전 모델입니다. 그들의 닫힌된 구조 및 중요 한 지원 기질, 3D 문화 호스트 병원 체 연구에 이상적입니다. Enteroids 또는 colonoids 둘 다의 조작 luminal 있도록 세포 막 투과성 조직 문화에 상피 monolayers로 수 basolateral 셀 표면 및 동반 체액. 이 향상 된 luminal 표면 접근성 용이 enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC)에 결 장 상피의 점액 저하 등 세균성 호스트 상피 상호 작용을 모델링. 3D 문화 조각화, 단층 시드, 및 transepithelial 전기 저항 (TER) 측정 confluency와 차별화를 향해 진행 상황을 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. Colonoid 단층 차별화 면역 형광 또는 immunoblotting 기법에 의해 공부 될 수 있다 분 비 점액을 생성 합니다. 더 일반적으로, enteroid 또는 colonoid monolayers 병원 성 또는 공생 microbiota 대상이 될 수 있습니다 특정 세포 인구를 평가 하는 생리 적으로 관련 플랫폼을 사용 합니다.

Introduction

장 organoids, enteroids, 및 colonoids 줄기 세포 행동, 장 개발, 배리어/전송 기능 및 세포 분화를 이해에 많은 발전을이 끌고있다. 그러나 1 , 3D 문화 제한 호스트 상피-병원 체 상호 작용의 연구 때문에 루멘은 세균에 직접 액세스할 수 없습니다 또는 독성 요인 닫힌된 구조는 microinjection에 복종 하지 않는 한. 2 , 3 또한, 작은 분자, 단백질, 등 자료를 분 비 또는 점액 다운스트림 분석에 대 한 3 차원 문화에서 쉽게 샘플링할 수 없습니다. 형광 염료를 사용 하 여 시간 경과 현미경, 3D 문화에서 상피 장벽 기능4 와 이온 수송5 에서 병원 성 대리인의 영향 평가 하지만 투과 조직 문화 지원에 성장 하는 monolayers는 의무가 TER 측정 및 Ussing 챔버/전압 클램프 녹음 등 추가 기술. 6 , 7

수많은 간행물의 enteroids/colonoids 2D 또는 단층 문화에 대 한 프로토콜을 설명 했습니다. 상피 세포 부착 홍보 자료 포함8,9 0.1% 젤라틴, 콜라겐 hydrogels10 얇은 레이어 murine 육 파생 지하실 멤브레인 매트릭스 (BMM),11,12, 13 과 인간의 콜라겐 IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 6,,1415 또는 트립 신,10,11 을 사용 하 여 세포 접착 요소의 분리를 pipetting으로 시드 접근 포함 기계적 조각 dispase,13 또는 EDTA입니다. 9 몇 가지 프로토콜, 시드의 비 다공성 조직 문화 plasticware 사용 하지만 이렇게 하면 제한 basolateral 액세스, 대부분의 응용 프로그램 삽입 침투성 조직 문화에 따라 달라 집니다. 안정적인 confluent 단층 형성 및 유지 보수 설명서는 간행물 중 넓게 변화 한다. 또한, 인간의 문화에 대 한 성장과 분화 미디어 작곡과 더 많은 연구자 채택 하 고 그들의 응용 프로그램 및 사용 가능한 리소스에 맞게 방법을 조정 진화를 계속 다양 한 그룹 사이 다.

3D 창 자 상피 문화 호스트 병원 체 상호 작용 연구에서의 한계를 해결 하기 위해 우리는 3 차원 인간 enteroids 또는 colonoids는 단층을 변환에 대 한 수정 된 프로토콜 제시. 토 굴 같은 미 숙 상태에서 confluency를 달성 한 후 성장 인자 WNT3A, RSPO1 및 A-83-01 및 SB 202190 억제제의 대표 작은 장 모 또는 표면 결 장 상피의 분화 이끌어 낸다. 이상적인 매트릭스, 인간의 콜라겐 유형 IV, 코트를 삽입 하 고 균일 한 enteroid 또는 colonoid 조각 도금을 설명 합니다. 시연이 프로토콜 TER. Colonoid monolayers 꼭대기 두꺼운 점액 층을 분 비 하는 높은 confluent 단층 생성 immunoblotting 또는 immunostaining를 통해 점액 병원 체 상호 작용의 ex vivo 연구에 대 한 허용 합니다. Immunostaining에 대 한 저 승 점액 레이어를 유지 하려면 수정된 고정 절차 또한 설명 되어 있습니다. 이 방법은 감염 시 초기 장 호스트 병원 체 상호 작용 연구를 세공 모델을 제공 하는 것을 목표로.

Protocol

이 프로토콜은 이전 저자 출판 연구를 기반으로 합니다. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 다음 단계 수행 되어야 합니다 밖으로 적절 한 무 균 기술을 사용 하 여 살 균 biosafety 내각에서. 인간 견본을 포함 하는 모든 메서드는 제도적 검토 보드의 존스 홉킨스 대학의과 대학 (IRB NA_00038329)에 의해 승인 되었습니다가지고. 1. 세포 외 매트릭스 셀 문화 삽입 코트 재고 콜라겐 IV 솔루션 (1 mg/mL) 100 mM 아세트산 5 mL를 준비 합니다. 서 4 ° C에서 약 4 시간 완전히 하이드 레이트/분해 하자. Aliquot 콜라겐 IV 솔루션을 재고 하 고 또는-20 ° C (> 1 개월) 4 ° C (≤ 1 개월)에 저장 합니다. 코팅, 직전 무 균 조직 문화 학년 물 34 μ g/mL의 최종 농도에 콜라겐 IV 재고 솔루션을 희석. 24-잘 접시 세포 배양 삽입, 코트 각 10 μ g/c m2에 해당 솔루션의 100 μ로 삽입 합니다. 표준 공동2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 ≥ 2 h, 접시를 품 어 또는 편의 위해 파라핀 영화와 접시 가장자리 물개 및 4 ° C 하룻밤 또는 최대 1 주에 품 어. 2. 격리 3D 문화에서 enteroids/colonoids 참고: Enteroids 또는 colonoids는 기증자 biopsies에서 설립 및 이전에 설명한 표준 프로토콜에 따라 3D 문화에서 유지. 14 , 18 짧게, 지하실은 장 생 검 또는 절제 chelation와 기계적인 동요를 통해에서 수확 됩니다. 지하실 세척, 수확, 고 BMM에 도금. 확장 미디어 (4.2 단계에서 설명) 문화에 추가 하 고 2 일 마다 교체 됩니다. 3 차원 문화 형성 도금 후 시간 표시 됩니다. 24-잘 접시에서 배양을 발음 하 고 1 mL 얼음 수확 솔루션으로 대체 ( 재료의 표참조) 잘 당. 미니 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 꺼내와 헤어 지하실 멤브레인 매트릭스 펠 릿, 어떤 자료 잘 가장자리 근처에 특별 한 관심을 지불. 약 200 rpm, 4 ° C 30-45 분 동안 궤도 통에 접시를 교 반 하십시오. 3. 해리 3D enteroids/colonoids P200 단일 채널 피 펫 또는 다중 채널 피 펫 멸 균 필터 팁으로 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 triturate. 15 mL 원뿔 유리병에 셀 suspension(s) 풀. 여러 개의 튜브를 사용 하 여 경우 총 정지 볼륨 > 6 mL. 10 mM HEPES, L-alanyl-L-글루타민 dipeptide (1x), 그리고 페니실린-스 (1x) 고급 DMEM/F12 매체의 동일한 볼륨을 추가 (세척 매체). 반전 튜브 3-4 회를 섞어. G, 10 분, 4 ° C x 300에서 원심 분리기 필요한 경우 세척 매체를 발음 하 고 0.5 mL/잘 trypsin 바꿉니다 ( 재료의 표참조). P200 피 펫으로 colonoids resuspend, 튜브 캡과 약 2 분 즉시 튜브를 제거, 10 mL의 최종 볼륨을 세척 매체를 추가 하 고 단계 3.3에서 원심 분리를 반복에 대 한 37 ° C 물 목욕에 놓습니다.참고:이 단계는 경우 분쇄 하지 결과 균일 하 게 크기의 조각에 바람직 있을 수 있습니다. 4. 도금 enteroid/colonoid 서 스 펜 션 코팅된 삽입 4 ° C에서 저장, 셀 도금 전에 적어도 30 분 동안 37 °C/5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 equilibrate. 각 삽입, 도금을 1 mL (25-37 ° C) 사이 따뜻한 확장 매체 (EM)을 준비 하 고 10 μ M Y-27632 및 10 μ M CHIR 99021 추가.참고: 그들은 구성의 고급 DMEM/F12 B27 포함 (1x), 50 %WNT3A 조절 매체, 15 %RSPO1 조절 매체, 10% 머리 조절 매체, 50 ng/mL 인간 EGF, 500 nM A-83-01, 10 μ M SB 202190, 항생제/antimycotic 칵테일 (1x), 10 mM HEPES, L-alanyl-L-글루타민 dipeptide (1x), 그리고 페니실린-스 (1x) ( 재료의 표참조). 셀 펠 릿을 포함 하는 관에서 세척 매체를 발음 하 고 적어도 100 μ/삽입을 충분 한 그들의 볼륨에 resuspend. 각 삽입에서 콜라겐 IV 솔루션을 발음 하 고 삽입 당 세척 매체의 150 μ로 두 번 씻어. 피펫으로 600 각 삽입 아래 공간으로 그들의 μ. 피펫으로 100 각 삽입에 세포 현 탁 액의 μ. 조직 문화 인큐베이터에 접시를 반환 하 고 12 시간 이상 그대로 둡니다.참고: 동요 하거나 크게 삽입 막에 colonoid 파편의 고르지 못한 배급을 방지 하기 위해 플레이트를 기울이기 하지 마십시오. 셀 첨부 파일을 모니터링 하 고 2.5 아래 단계 대조 조명 현미경에 접시를 두어서 confluent 단층을 형성 확산 렌즈 x x-10. 1-2 일 후, 대부분 파편 콜라겐 매트릭스를 준수 한다. 문화 매체를 새로 고침 하 고 Y-27632와 CHIR 99021 치료 중단. 매체를 합칠 때까지 2-3 일 마다 새로 고침을 계속 합니다. Confluency는 일반적으로 7-10 일에 도달 했습니다. 5. 측정 transepithelial 전기 저항 전극 리드와 상피 voltohmmeter (EVOM)에 전원을 연결 합니다. 옴으로 측정 기능이 설정 되어 있는지 확인 합니다. 짧게 70% 에탄올에에서 전극 팁와 실험실 휴지로 건조 닦아. 약 5 분 동안 세척 매체의 5 mL에 전극 equilibrate 삽입 매체에 짧은 전극 팁을 담가 그리고 낮은 잘 접시에 긴 전극 팁의 방향을. 유지 전극 EVOM 읽기는 상대적으로 안정 될 때까지 전체 수직 방향에서 또는 60 보다는 더 이상에 대 한 s.참고: 경우 전극 어셈블리를 수직 멀리 기울이면 또는 팁 높이 조정 잘못, 짧은 팁 수 접촉으로 서 셀 단층을 방해. EVOM 측정 셀 무료 삽입 confluency 또는 차별화 진행 상황을 평가 하는 문화 매체에 빠져들에서 얻은 값을 비교 합니다. 6. confluent enteroid/colonoid monolayers의 차별화 차별 매체 (DM)에 대 한 그들을 교환 하 고 새로 미디어까지 하루 5 매 2 일 계속. DM은 부족 WNT3A, RSPO1, EM A-83-01, 및 SB 202190. TER 예상 대로 차별화 진행 되었는지 확인 하려면 모니터를 계속 합니다. TER는 차별화의 1-5 일 동안 계속 됩니다. Monolayers는 TER 증가 주 5-6을 넘어 생존을 유지 하지만 하루 5-6에서 사용 하는 경우 최대한 가장 재현성 결과 전시를 계속 수 있습니다. 7. 세균 공생 또는 병원 성 대장균 감염 감염, 수행에 앞서 1 일 세척 하 고 항생제 없는 그들 또는 DM monolayers 피드. 살 균 미생물 루프를 사용 하 여 부드럽게 냉동된 세균성 글리세롤 재고의 표면을 긁어 파운드 국물의 2 개 mL를 접종 하. 12-16 h 37 ° C에서 인큐베이터를 떨고 표준 튜브를 전송 합니다. 5 mL 신선한 파운드 국물 (1: 100)로 선발 문화 50 μ를 희석 하 고 90 분 동안 흔들어 가진 외피를 계속 합니다. 이 로그 단계 문화 105-106 콜로 니 형성 단위 (cfu)의 밀도 얻을 것입니다 / mL. 필요한 경우, 600에서 광학 밀도 측정에 의해 세균 농도 확인 한 분 광 광도 계에 nm (OD600). 10 분 동안 12000 x g에서 세균성 문화 아래로 회전 시키십시오, 상쾌한, 제거 하 고 박테리아 항생제 없는 그들 또는 DM 107 cfu/mL의 최종 농도에 resuspend. 세균 현 탁 액의 10 μ 삽입 (최종 농도 106 cfu/mL)을 추가 합니다. 피펫으로 천천히 혼합 하 고 extracellular 점액 레이어를 방해 하지 마십시오. 원하는 감염 기간에 대 한 조직 문화 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 8. 보존 및 immunostain 점액을 고정 세포 배양 24-잘 접시에서 삽입 리프트 꼭대기 매체를 제거 하 고 삽입에 기대 며 멀리 외부 액체를 닦아 실험실 휴지에 신중 하 게 반전. 새로운 24-잘 접시에 빙 초 산에 절대 에탄올 (클라크의 솔루션) 실 온에서 10 분의 1:3 솔루션에 삽입을 담가. 반전 하는 정착 액을 제거 하 고 10 분 진행 표준 immunostaining 프로토콜에 대 한 1 x PBS에 셀 rehydrate 하 삽입. 면도날을 사용 하 여 삽입 막의 둘레의 주위에 잘라. 집게를 사용 하 여 유리 현미경 슬라이드를 막 전송 하 고 장착 매체 coverglass 부착. 9입니다. immunoblotting 세포 lysates의 준비 참고: 다음 단계를 수행 하는 얼음 또는 차가운 방에. Aspirate 매체와 세척 PBS와 한 번에 삽입합니다. 150 μ 세포의 용 해 버퍼 포함 protease 억제제 (재료의 표 참조)는 삽입을 추가 하 고 5-10 분 스탠드 하자 세포의 용 해 버퍼 포함 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 0.1 %SDS, 1: 100 프로 테아 제 억제 물 칵테일. 미니 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 삽입에서 셀을 제거 하려면 다음 P200 피 펫을 사용 하 여 간단히 펜션과 microcentrifuge 튜브에 triturate. 5 x 1 정지 sonicate s 펄스는 microtip을 사용 하 여 20% 진폭에서 프로브 ( 재료의 표참조). 전기 이동 법, 또는 약 수를 즉시 수행 하는 경우 SDS 페이지 로딩 버퍼를 추가 하 고 저장 lysates-20 ° c.에

Representative Results

인간 enteroid 및 colonoid 문화 3 차원 구조로 성장 다음 해리 고 인간의 콜라겐 4 코팅 셀 문화 삽입에 도금에 대 한 조각. 단층 형성의 진행 쉽게 반영 transepithelial 전기 저항 (TER) (그림 2), 밝은 분야 현미경 검사 법, 면역 형광 검사 (그림 1), 얼룩을 통해 그리고 꾸준한 증가 의해 매일 모니터링 이온을 단층 confluency와 관계가 긴밀 접합의 침투성. 빈 24 잘 삽입의 테는 약 50-100 Ω·cm2및 confluency에 도달 시 약 400-500 Ω·cm2증가. 모든 상피 세포 confluent monolayers 접합 단지 F 걸 링 셀 경계에 의해 감지에 의해 연결 되어 (그림 1). Monolayers 전체 증가율 미디어에서 대표 증식 토 굴 같은 상피 세포는 nucleoside을 통합 하는 적극적으로 나누어 주로 구성 되어 아날로그 듀 (그림 2). 성장 인자 WNT3A와 RSPO1의 증식 세포 부족 모 같은 문화를 선도 하는 차별화를 촉진 합니다. 차별화 된 monolayers enterocytes (enteroids) 또는 colonocytes (colonoids)를 포함 하 고 3 차원 문화,18 등 잔과 enteroendocrine 셀에에서 표시 된 것 처럼 전문된 장 상피 세포를 개발 합니다. 15 분화 된 monolayers 또한 TER (> 1000 Ω·cm2)에 상당한 증가 보여 줍니다 (그림 2), 성숙 꽉 교차점을 나타내는. 정상적인 인간 생리학에서 장 상피 층 멸 균 serosal 환경에서 영양분과 미생물 농축 luminal 공간 분리합니다. 상피는 밀접 하 게이 2 개의 구획 사이 크로스 토크를 통제 한다. Enteroid 및 colonoid monolayers 보존이 중요 한 구획 속성에서 proteomic 분석에서와 같이 표 1. 단백질 구성 꼭대기에 상당한 차이가 있다 그리고 basolateral 조건 차별화 된 enteroid monolayers에서 수집 된 미디어. 혀끝과 basolateral 양쪽 모두에 대 한 액세스 cytokines, 발산 등 다른 분자의 차동 분 비의 측정 시간 종속 방식에서 모두 supernatants의 컬렉션에 대 한 수 있습니다. 15 , 17 Monolayers는 단백질 표정 immunoblotting 및 immunostaining를 사용 하 여 변경 내용을 감지 하 편리 하 고 매우 재현 모델입니다. 따라서, 변경 mucin 2 (MUC2)에서 식 shRNA 최저 (KD)에 의해 검출 될 수 있다 두 기법 (그림 3)를 사용 하 여. ShRNA 변환 3D colonoids에 수행 되었고 항생제 선택 미디어에서 유지. KD를 확인 한 후 colonoids 수 수 지속적으로 3D 문화 유지 및/또는 실험적인 목적을 위한 monolayers로 도금. 또한, MUC2 KD 단층 형성 야생 타입 부모의 colonoid 라인에 비해 효율을 미치지 않습니다. Immunoblotting에 대 한 monolayers의 컬렉션은 간단 하 고 인간 상피 선 암 파생 셀 라인에 대 한 설명 하는 프로토콜에 비슷합니다. 일반적으로, 전체 단백질의 약 50 µ g 이상의 단일 0.33 c m2 삽입 성장 단층에서 추출할 수 있습니다. 그림 3에서 보듯이 MUC2 undifferentiated (UD) WT colonoid monolayers에서 거의 감지 하지만 매우 차별화 된 (DF) WT monolayers에 표시 됩니다. MUC2는 MUC2 shRNA로 불리고 UD와 DF colonoid monolayers에서 수준입니다. 중요 한, monolayers는 epithelia의 꼭대기 표면에 호스트-미생물 상호작용 연구에 적합 한 모델입니다. 공생에 의해 쉽게 침투 하지는 차별화 시 두꺼운 첨부 MUC2 양성 점액 층을 형성 하는 Colonoid monolayers 대장균 HS 박테리아 (그림 4), 무슨 정상적인 인간의 콜론에 제안 되었습니다 비슷합니다. 그러나 19 enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC), 인간의 저 승 병원 체, 표시 되었습니다 (그림 4) 상피의 꼭대기 표면 도달 MUC2 농축 된 점액 레이어를 파괴 하는 능력을가지고. 14 , 20 나머지 MUC2은만 잔 셀 안에 존재 합니다. 그림 1: 의 인간 enteroid/colonoid monolayers. (A) colonoid의 예 BMM과 분쇄의 해산 후 파편. Colonoid 조각 도금 후 즉시 삽입의 (B) 예. (A-B) 바 규모 200 μ m =. 대표 (C) 최대 강도 프로젝션 및 (D) 공초점 광학 Z-섹션 해당 직교 투영으로 보여 colonoid 조각 인간 콜라겐 4 코팅 필터 폼에 여러 개의 단층 제도 시드 2-4 일 후 시드입니다. 셀 자유로운 지역 (별표)는 둘 다 핵의 부재 (Hoechst 33342, 블루)에 의해 식별 꼭대기 F-말라 (phalloidin, 녹색) confocal C와 D. 대표 (E) 최대 강도 프로젝션 및 (F) 에 얼룩 및 광학 해당 직교 계획 섹션 F 걸 immunostaining 약 1 주일 후 시드 감지 연속 꼭대기 서피스와 confluent colonoid 단층을 표시 합니다. (G)는 대표적인 최대 강도 프로젝션 및 해당 직교 투영 (H) 공초점 광학 섹션의 높은 확대 표시 confluent colonoid monolayers 셀 F 걸 perijunctional 형성 반지 (흰색 화살표) 고 미 숙 꼭대기 브러시 테두리 (노란색 화살표 머리). (C-H) 바 규모 = 20 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: enteroid/colonoid 단층 차별화의 평가. (A) 듀 (레드) 설립 jejunal 단층 차별화 중 확산의 진보적인 손실을 보여줍니다. 확장 또는 차별화 매체에 confluent jejunal monolayers에서 (B) 평균 TER 측량. 오차 막대를 나타내는 SEM. 총, undifferentiated; DF, 분화 지정된 된 조건;에서 일에 해당 하는 숫자 UD1은 confluency의 첫번째 날에 시드 후 약 1 주일 이었다. (C) 총 jejunal monolayers 있고, 짧은 셀 DF 5 일 jejunal monolayers 보다 덜 성숙 꼭대기 말라 기반 브러시 테두리. (A, C) 바 규모 50 μ m =. 모든 monolayers 했다 적어도 1 주 후 시드 묘사와 차별화 하기 confluent 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: 야생 유형 colonoids 및 shRNA 불리고 최저 (KD) colonoids 각 양식 confluent monolayers. (A) 5 일 동안 야생 타입 (WT) 인간의 confluent colonoid 단층의 대표 이미지 차별화와 MUC2 KD colonoid 문화에서 파생 된 (B) 마찬가지로 monolayers를 성장. (A-B) 바 규모 = 50 μ m (C) 대표 immunoblot 스크램블된 shRNA 또는 MUC2 shRNA 불리고 colonoid 문화의 immunoblot에 의해 단백질 표정 KD 때문에 변화를 quantitated 수 있습니다 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: Enteroid/colonoid monolayers luminal 미생물-호스트 상호 작용을 공부 하기 적합 한 모델입니다. (A) 대표 최대 강도 투영과 직교 광학 부분의 colonoid 단층 보여줍니다 대장균 HS (검은 화살표)에 융 화 되지 않는 두꺼운 꼭대기 MUC2 양성 점액 레이어 꼭대기 점액에 앉아 표면입니다. 단층 106 cfu/mL HS와 함께 6 시간에 대 한 감염 되었다. 제 (B) 호 apically (106 cfu/mL, 6 시간) EHEC 감염 인간 colonoid 단층 소자 대표 최대 강도 투영 (A-B) 바 규모 50 μ m =. (C) MUC2 면역 형광 강도 측정 EHEC 감염 colonoid monolayers 감염 되지 않은 컨트롤에 비해 MUC2에 상당한 감소를 보여줍니다. 오차 막대를 나타내는 SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 단백질 승인 번호 펩 티 드 풍부 Basolateral 미디어 지방산 의무적인 단백질, 간 [호모 사피엔스] NP_001434.1 1299 [호모 사피엔스] profilin-1 NP_005013.1 797 apolipoprotein A 4 전조 [호모 사피엔스] NP_000473.2 744 ecto-ADP-ribosyltransferase 4 전조 [호모 사피엔스] NP_066549.2 633 glyceraldehyde-3-인산 효소 isoform 1 [호모 사피엔스] NP_002037.2 (+ 1) 616 serotransferrin 선구자 [호모 사피엔스] NP_001054.1 (+ 1) 572 비타민 D-바인딩 단백질 isoform 3 전조 [호모 사피엔스] NP_001191236.1 (+ 2) 567 카 탈 라 제 [호모 사피엔스] NP_001743.1 427 agrin isoform 1 전조 [호모 사피엔스] NP_940978.2 (+ 1) 377 lactotransferrin isoform 1 전조 [호모 사피엔스] NP_002334.2 (+ 1) 262 꼭대기 미디어 개미 자리의 요소 3 전조 [호모 사피엔스] NP_003217.3 326 개미 자리의 요소 1 전조 [호모 사피엔스] NP_003216.1 304 지하실 멤브레인 관련 heparan 황산 proteoglycan 핵심 단백질 isoform 전조 [호모 사피엔스] NP_001278789.1 (+ 3) 303 filamin-B isoform 1 [호모 사피엔스] NP_001157789.1 (+ 2) 240 개미 자리의 요소 2 전조 [호모 사피엔스] NP_005414.1 182 악성 뇌 종양 1 단백질 isoform b 전조 [호모 사피엔스]에서 삭제 NP_015568.2 (+ 3) 169 각 질, 유형 II cytoskeletal 1 [호모 사피엔스] NP_006112.3 157 myosin-9 [호모 사피엔스] NP_002464.1 150 aminopeptidase N 전조 [호모 사피엔스] NP_001141.2 (+ 1) 145 agrin 전조 [호모 사피엔스] NP_940978.2 (+ 1) 112 표 1입니다. 꼭대기에서 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석에 의해 확인 된 펩 티 드 그리고 basolateral 체액에서 샘플링의 일부 목록 구분 jejunal monolayers.

Discussion

Enteroid/colonoid monolayers의 성공적인 형성에 대 한 중요 한 매개 변수 1 포함) 건강, 확산 3D 문화로 시작 물자; 2) 단층 시드; 전에 인간의 콜라겐 IV 세포 문화 삽입 표면 코팅 3) 3D의 조각화 문화 기계적으로 또는 효소, 하지만 단일 셀 수준.

3D enteroids/colonoids의 격리, 동안 최적의 떨고 속도 주어진된 통 모델의 회전 직경에 따라 달라질 수 있습니다. 의도 뿐만 아니라 교 반 하십시오 접시는 효율적인 믹싱, 하지만 또한 세포 현 탁 액 또는 격판덮개 덮개에 splashing 피하기 위해 인접 한 우물에. < 30 분의 부 화 기간 잔여 BMM 셀, 첨부 파일 및 삽입에 도금 하는 경우 균일 한 셀 monolayers의 형성을 방해 할 수 있는 걷기를 얻을 수 있습니다. 광범위 한 외피 (≥ 1 h) 크게 감소 세포 생존 능력을 얻을 것입니다.

3D enteroids/colonoids를 분리 하는 데 필요한 분쇄의 범위는 피스톤 강성 및 사용자 손 재주와 달라질 수 있습니다. 단계 대조 조명 현미경에 잘 내용의 정기 검사 조각 당 약 30 셀의 목표와 함께 분쇄 동안 조각 균일성을 확인 하는 것이 좋습니다. 에 대신, 또는 분쇄, 현 탁 액 트립 신 작은 균일 한 조각을 얻을 수와 함께 짧게 소화 수 있습니다. 트립 신 다이제스트 바람직한 monolayers 3D-같은 구조는 다른 상피 층 가운데의 큰 비율을 포함 하는 경우 있을 수 있습니다. 그러나, 단일 셀에 분리 바람직하지 않다로이 크게 세포 생존 능력을 감소. Enteroids/colonoids는 35 μ BMM 물방울에 교양의 한 잘 일반적으로 충분 한 것입니다 2-3 삽입을 하지만이 요소 수 및 enteroids/colonoids의 평균 크기에 따라 다를 수 있습니다.

Colonoid monolayers 그들은 차별화로 꼭대기 매체의 상당한 볼륨을 흡수할 수 있습니다. 이 추가 DM 상단 삽입 챔버 (150-200 μ)을 적용 하 여 피할 수 상단 챔버의 부분적인 건조 단층 생존 또는 다운스트림 분석 실험에 기능 저하를 표시 되지 않습니다. 차별화의 약 4-5 일 후 colonoid monolayers 개발 extracellular 점액 DM의 주의 깊은 열망 후 세포 표면에 두께/젤라틴 자료로 볼 수 있습니다.

EHEC 외부 점액 레이어와 상호 작용, 우리는 정기적으로 세균 titer 및 부 화 기간 프로토콜에 지정 된 사용 합니다. 그러나, 독특한 세균성 긴장 처음 여러 농도 및 원하는 효과 대 한 적절 한 매개 변수를 결정 하기 위해 부 화 기간에 분석 한다.

점액 고정, 동안 꼭대기 중간 발음 extracellular 별도 점액 층의 가장 가능성이 제거 됩니다. 따라서, 그것은 신중 하 게 매체에 밖으로 부 어 하는 것이 중요입니다. 매체 표면 장력에 의해 삽입에 유지 하는 경우는 접힌된 연구소 조직의 모서리를 사용 하 여 표면 장력을 깰 매체의 대부분을 멀리 심지. 고정 후에 얼룩, 점액 레이어 수 실수로 제거 또는 삽입 필터에는 coverglass 장착 하는 동안 병합. 점액 높이 유지 하려면 필터 미디어를 장착 한 방울에 놓고 필터에는 coverglass를 신중 하 게 배치 합니다. 탭 하거나이 크게 점액 레이어를 평평 수로 coverglass 눌러 마십시오.

3D 문화에 셀에서 편광된 단층을 형성, 그것은 장 상피 세포의 basolateral 막 integrins 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 상호작용을 재현 하는 데 필요한. Laminin, 콜라겐 IV, fibronectin, proteoglycans 배열 구성 장 상피 ECM. 21 , 22 우리는 비교 인간의 세포 유래 laminin, fibronectin, 콜라겐 IV, 및 파생 murine BMM 삽입 코팅으로. 콜라겐 IV 지원 안정, 장기 (최대 4 주)의 대형만 confluent enteroid/colonoid monolayers (그림 1-2). 단층 처럼 성장의 작은 패치 다른 테스트 매트릭스의 각 가져온 하지만이 지역 confluency를 진행 하지 못했습니다. ECM 대리는 다양 한 장점으로 인간의 콜라겐 IV의 사용 합니다. BMM 파생에서 Engelbreth-Holm-떼 (EHS) murine 육 종 세포는 인간의 기원의 되지 않습니다 인간의 콜라겐 IV는 상업적으로 사용할 수 있으며 일반적으로 더 많은 비용. 또한,는 BMM 고유의 가변성, 단백질의 복잡 한 혼합물 이며 성장 인자는 육 종에 의해 분 비 유전자 발현에 영향을 주는 포함 될 수 있습니다. 23

장 상피 세포와 장 상피 배상에 기본 ECM 사이 상호 작용은 아직도 불완전 하 게 이해 된다. 인간 colonocytes24 및 장 토 굴 상피 세포 회복25 의 증강에 대 한 접착 ligand로 콜라겐 IV, 하지만 하지 laminin의 중요성 콜라겐 IV 첨부 파일에 대 한 항 체를 사용 하 여 제안 하고있다 . 상피 표현 β1 integrin β1 integrin에 대 한 특정 항 체는 크게 4 콜라겐 입력 colonocytes의 접착 차단 ECM 상호 작용에 대 한 중요 한 것 같다. 24 콜라겐 IV는 신뢰할 수 있는 ECM을 제공 한다 enteroid/colonoid 단층에 대 한 삽입, ECM의 개장 하는 시간이 지나면서 상피에 아직 평가 되지이 모델에도 더 복잡 하 고 정의 된 ECM 혼합물의 영향 콜라겐 IV, laminin, 그리고 fibronectin입니다.

(그림 1-4) 단층 형식에 인간 enteroids/colonoids 사용 조작 하 고 성가신 또는 3D 매트릭스에 포함 된 culture를 사용 하 여 불가능 한 것을 샘플링. 3D enteroids/colonoids 크기, 구조 복잡성 및 luminal 볼륨에서 변화 하 고 따라서 미생물 또는 작은 분자의 microinjection는 정확 하 게 quantitate 어렵다. 또한, monolayers (표 1), 달리 3D 문화 직접 액세스를 방지 이온, 양분, cytokines 또는 분 비 요인 생리 또는 pathophysiologic 프로세스와 관련 된 측정 하 고 basolateral luminal 표면 . Confluency (그림 1-2) 뿐만 아니라 영양소의 생리 그라디언트, 이온, 그리고 다른 고분자,16 을 설정 하지만 적절 한 장벽 만들기에 필요한 enteroid/colonoid 단층의 주요 속성 중 하나입니다. luminal microbiota 살 균 엽/면역 세포 채워집니다 serosal 환경 사이. 이러한 측면은 더 복잡 한 생리 적 모델 구축 하 엽, 면역, 또는 신경 세포 유형 enteroid/colonoid monolayers를 통합 하는 미래 연구에 대 한 고려 하는 중요 합니다.

여기에 설명 된 셀 문화 삽입 모델의 지적된 한계 유체 전단 응력 등의 기계적 스트레치/압축 (연동), 물리적 힘의 부족 등 혐 기성 꼭대기 환경 창 자에 의해 일반적으로 경험의 부재 epithelia vivo. 이러한 요소는 더 정교한 microphysiological 플랫폼,26 으로 해결 될 가능성이 그러나 또한 추가 비용, 장비, 및 구현 하는 전문 지식을 요구 한다. 이러한 구성 요소는 의도적으로 추가 하지 않으면 3D 및 단층 문화 상호 작용 또는 장내 미생물, stromal 세포 인구, 그리고 면역 시스템에서 기여 없이 있습니다.

콜라겐 4 코팅 셀 문화 삽입에 enteroid/colonoid 단층의 미래 응용 프로그램 병원 성 또는 공생 미생물 상호 작용, 약물 또는 양분 통풍 관, 독성, 신진 대사, 장벽 기능, 다른 연구에 포함 될 수 있습니다와 기능 향상 추가 장 셀 종류와 공동 문화 촉매. 평가 할 수 있다 유전자 변이 또는 창 자 장애를 가진 개인에서 뿐만 아니라 건강 한 기증자의 epithelia 내의 뿐만 아니라 vivo에서 고기는 ex vivo enteroid/colonoid 문화 보존을 설립 하는 제공.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI), 보조금과 K01 DK113043 (축구 협회)에 의해 지원 되었다. 우리가 제임스 Kaper (메릴랜드 대학, 볼티모어, 메릴랜드, 미국) 제공에 감사 대장균 HS와 EHEC 스트레인. 우리는 또한 통합 생리학과 홉킨스 콘 테 소화 질병 기본 들어가게 연구 핵심 센터 (P30 DK089502)와 존스 홉킨스 질량 분석 및 Proteomics 코어의 코어 이미지를 인정합니다.

Materials

2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol Sigma T4661 Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01 Tocris 2939 ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010 Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin Life Technologies A12379 Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail Invivogen ant-pm-2 Primocin (100x)
B27, 50x Life Technologies 17504-044 Component of growth medium
Cell culture inserts Corning 3470 Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021 Tocris 4423 GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life Technologies C10639
Collagen IV, from human placenta Sigma C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution Trevigen 3700-100-01 Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode World Precision Instruments STX3
Escherichia coli strain HS Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute Pharmco 111000200
FluorSave mounting medium Millipore 345789 For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line Trevigen 3710-001-K For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M Life Technologies 15630-080 Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004250
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF) R&D Systems 236-EG-01M Component of growth medium
IGEPAL CA-630 Sigma I8896 Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope Olympus CKX51
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
L-WNT3A cell line ATCC CRL-2647 For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced Corning 356231 Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper United BioSystems MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal Abcam ab11197 Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles GE Dharmacon RHS4531 GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker Grant Instruments PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x Life Technologies 15140-122 Component of growth medium
Phosphate buffered saline Corning 21-031
Probe sonicator with microtip Branson Ultrasonics 450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells Sigma P8340 Component of lysis buffer
SB 202190 Tocris 1264 p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride Sigma S3014 Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate Sigma D6750 Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate Sigma L3771 Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x Life Technologies 12605-010 Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal Abcam ab129002 Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered Corning 25-055
Y-27632 Tocris 1254 RhoA/ROCK inhibitor
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In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium. J. Vis. Exp. (146), e59357, doi:10.3791/59357 (2019).
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