二维和三维 i 型胶原蛋白基质角质形成细胞增殖的评价

1. 角质形成细胞培养基的制备 注: 在无菌条件下执行所有过程。 使用移液器加入5毫升青霉素链霉素和10毫升的添加剂补充 k-1 至500毫升 K110 型 ii 培养基 (K110)。 2. I 型胶原蛋白纤维形式的制备 注: 在无菌条件下执行直到步骤2.6 的过程。 保持10倍磷酸盐缓冲盐水 (PBS (-)), 去离子水, 胶原蛋白, 96 孔培养板, 和一个空的2毫升管在冰上。注: 不要使用相同的板材来制备纤维和非纤维形式。 使用移液器将1.12 毫升的去离子水加入空的2毫升管中。使用移液器将200μl 的 10倍 PBS (-) 添加到2毫升管中的去离子水中。轻轻晃动了几下管子。 使用移液器将0.66 毫升的胶原蛋白添加到2毫升管中。轻轻地快速晃动了几下管子。注: 尽可能避免溶液中的气泡形成。在使用前立即准备胶原蛋白溶液。 将步骤2.3 中的胶原蛋白溶液的100μl 注入96孔培养板的每一口井。轻轻地将培养板从左到右移动。注: 用胶原蛋白溶液覆盖井的整个表面。如果溶液不能覆盖整个表面, 请使用移液器尖端展开溶液。尽可能避免溶液中的气泡形成。 将培养板放入 CO2 孵化器中, 在37°c 孵育 1小时, 检查胶原蛋白的凝胶化程度, 将培养板移动到干净的长凳上。注: 通过倾斜培养板确认凝胶化。 用移液器在井壁上的凝胶上轻轻倒 150μl K110 k110, 将培养板放入 co2 孵化器中,在37°c 孵育 1小时, 将培养板移动到干净的长凳上。在细胞培养之前, 使用移液器轻轻丢弃 K110。注: 为了保护凝胶, 移液器的尖端应触摸井壁。 3. I 型胶原蛋白非纤维化形式的制备 注: 在无菌条件下执行所有过程。 在 1.5 mL 管中加入4μl 胶原蛋白, 加入 1.2 Ml 盐酸 (HCl), 然后使用移液器轻轻混合。注: 使用前立即准备胶原蛋白。保持胶原蛋白和 HCl 冷却, 直到使用的时间。 使用移液器将100μl 的胶原蛋白倒进96孔培养板的每一口井中。轻轻摇摇培养板在左至右的运动和孵育在室温下1小时。注: 确保井的整个表面覆盖有溶液。 孵育后, 丢弃胶原蛋白溶液, 用 PBS (-) 用移液器清洗两次井。 将1% 牛血清蛋白的 150μl (-) (1% BSA) 倒在96井培养基的井上, 在室温下孵育 1小时. 在细胞培养之前, 丢弃 1% BSA。注: 确保井的整个表面覆盖有溶液。 4. FEPE1L-8 细胞的培养 注: 在无菌条件下执行所有过程。 将 FEPE1L-8 细胞保存在 K110 的100毫米培养盘中, 放入 CO2 孵化器中, 在37°c 和 5% CO 2 中孵育, 保持半融合. 在37°c 的水浴中制备 K110、胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂。 小心地从培养皿中取出培养基, 使用移液器加入0.05% 胰蛋白酶3毫升, 将培养皿放入 co2 孵化器中, 在 37°c 孵育5分钟。孵育后, 在10倍放大倍率下, 用相对照显微镜检查培养盘表面的细胞脱离情况。注: 分离细胞的形态变为圆形。如果细胞扩散, 再孵育5分钟。 加入3毫升的胰蛋白酶抑制剂, 用移液器将分离细胞收集在15毫升离心管中。以 200 x g 的速度将细胞离心5分钟。 丢弃上清液, 使用移液器在 K110 的10毫升中重新悬浮颗粒。用10倍放大的相对比显微镜对细胞进行计数, 用 K110 适当稀释, 在 5.0 x10 4 细胞中制备细胞浓度。 用沿着井壁的移液器在培养板的每个井中轻轻播种0.1 毫升的 K110。将培养板放入 CO2 孵化器中, 在指定时间 (2小时、1天、3天) 在37°c 孵育。注: 为了保护凝胶, 移液器的尖端应触摸井壁。 5. 活细胞数量的估计 在37°c 的水浴中培养 K110。混合130μl 四唑盐, 2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-(2, 4-二苯甲苯基)-5-(2, 4 -二苯甲酰)-2 h 四唑、单钠盐 (wst-8) 和 1.3 ml 的 k110 在2-ml 管使用的液管。 将培养板移动到干净的长凳上, 然后使用移液器轻轻丢弃 K110。用移液器用 K110 轻轻冲洗非粘附细胞 使用移液器在每口井中加入 110μl K110 与 WST-8 混合, 将培养板放入 co2孵化器中, 在37°c 孵育2小时。 将培养板移动到干净的长凳上, 从每口井收集100Μl 的条件介质, 并将其移动到另一个96孔培养板的井中。使用微板读取器测量波长为 450 nm (OD450) 的吸收率, 并估计活细胞的数量。