Bir Flavanone bir Flavonol Biyosentezi Bir-pot Bienzymatik Cascade Kurarak
Summary
Bir flavonol türevi sağlık ve gıda sektöründe uygulanması için çok önemlidir. Burada, flavanondan bir flavonolün biyosentezi için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz ve diğer yaklaşımlara göre önemli adımları ve avantajlarını tartışıyoruz.
Abstract
Flavonoller çeşitli biyolojik ve farmakolojik aktivitelere sahip flavonoidlerin önemli bir alt sınıfıdır. Burada, bir flavonol in vitro enzimatik sentezi için bir yöntem sağlar. Bu yöntemde, Atf3h ve Atfls1, flavonollerin biyosentetik yolu iki anahtar genler, klonlanmış ve Escherichia coliaşırı ifade edilir. Rekombinant enzimler bir yakınlık sütunu ile saflaştırılır ve daha sonra belirli bir sentetik tampon da bienzimatik basamak kurulur. Bu sistemde iki flavonol örnek olarak sentezlenir ve TLC ve HPLC/LC/MS analizleri ile belirlenir. Yöntem diğer yaklaşımlar üzerinde flavonoller türeyen belirgin avantajlar görüntüler. Bu zaman ve emek tasarrufu ve son derece uygun maliyetli. Reaksiyonun doğru bir şekilde kontrol edilmesi kolaydır ve böylece seri üretim için ölçeklendirilir. Hedef ürün, sistemdeki basit bileşenler sayesinde kolayca saflaştırılabilir. Ancak, Bu sistem genellikle bir flavanon bir flavonol üretimi ile sınırlıdır.
Introduction
Flavonoller bitki flavonoidlerin önemli bir alt sınıfıdır ve bitkigeliştirme ve pigmentasyon 1,2,3katılır. Daha da önemlisi, bu bileşikler sağlık açısından yararlı faaliyetleri geniş bir yelpazede sahip, anti-kanser gibi4,5, anti-oksidatif6, anti-inflamatuar7, antiobezite8, anti-hipertansif9 , ve bellek hatırlama özellikleri10, bu bitki kaynaklı ikincil metabolitleri üzerinde çalışmalar çok sayıda yol açan. Geleneksel olarak, bu bileşikler esas olarak organik çözücüler kullanılarak bitki çıkarma elde edilir. Ancak, bitkilerde çok düşük içeriği nedeniyle11,12,13, en flavonoller için üretim maliyeti yüksek kalır, hangi sağlık ve gıda uygulamaları üzerinde büyük kısıtlamalar empoze Sanayi.
Son yıllarda, bilim adamları flavonoidler 14,15türetmek için yöntemler oldukça sayıda geliştirdik. Ancak, bu karmaşık moleküllerin kimyasal sentezi içsel dezavantajları çeşitli sahip16. Sadece toksik reaktifler ve aşırı reaksiyon koşulları gerektirir, ama aynı zamanda bir hedef flavonoid bileşik üretmek için birçok adım14,17. Ayrıca, bu stratejide bir diğer önemli sorun aktif flavonoid moleküllerin chiral sentezidir. Bu nedenle, kimyasal sentez ihrama yoluyla ticari bir ölçekte flavonoidler üretmek için ideal bir strateji değildir16,17.
Son zamanlarda, bilim adamları flavonoid biyosentez için bir yol ile mühendislik mikroplartarafından bu karmaşık doğal bileşikler üretmek için umut verici bir alternatif strateji geliştirdik18,19,20, 21.000 , 22, hangi başarıyla bitkilerde deşifre edilmiştir23. Örneğin, Duan ve ark kaempferol üretmek için tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae içine biyosentetik bir yol tanıttı (KMF)24. Malla ve ark.flavanone 3-hidroksilaz (f3h),flavonol synthase(fls1)ve UDP-glukoz:flavonoid 3-O-glukoziltransferaz UGT78K1 genleri ile tanıştırarak, glikozile flavonol, bir glikozile flavonol üretti Escherichia coliBL21(DE3)17. Oldukça az paradigma olmasına rağmen, tüm genetiği değiştirilmiş mikroplar hücresel bir platformun karmaşıklığı, yapay olarak sentezlenen genetik elementler ve konaklar arasındaki uyumsuzluk, inhibitör nedeniyle ilgi ürünleri üretmek konak hücrelere karşı hedef ürünlerin etkisi ve tasarlanmış bir hücresel sistemin kendisi istikrarsızlığı16.
Flavonoid üretimi için umut verici bir alternatif strateji in vitro multienzymatik bir basamak kurmaktır. Cheng ve ark. enterocin poliketides başarıyla bir pot25tam bir enzimatik yol montajı ile sentezlenebilir bildirdin. Bu hücre içermeyen sentetik strateji bir mikrobiyal üretim fabrikasının kısıtlamaları afordan ve böylece büyük miktardabazı flavonoidler üretmek için mümkün 16 .
Son zamanlarda, naringenin dönüştürmek için bir bienzim sentetik sistem geliştirdik (NRN) kmf içine bir pot16. Burada, bu sistemi büyük ayrıntılarla ve ürünlerin analizinde yer alan yöntemlerle tanımlıyoruz. Ayrıca bu sistemi eriodictyol’dan NRN ve quercetin (QRC) kmf üretmek için kullanan iki örnek salıyoruz. Buna ek olarak, flavonoidlerin biyosentezinde bu yöntemin önemli adımlarını ve gelecekteki araştırma yönlerini tartışıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pek çok çalışma, sağlık ve gıda endüstrisindeki potansiyel uygulamaları nedeniyle flavonollerin türemesi üzerine odaklanmıştır. Ancak, organik çözücüler ve kimyasal sentez kullanarak geleneksel bitki çıkarma flavonolüretiminde kullanımını kısıtlayan içsel dezavantajları vardır. Burada, bir in vitro bienzymatik kaskad kurarak bir tencerede bir flavanone flavonol üretmek için ayrıntılı bir yöntem rapor. Bu protokoldeki kritik adımlar şunlardır: 1) yüksek aktivite ile saf rekombinant e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Yangzhou Üniversitesi Özel Olarak Atanan Profesör Start-up Fonları, Jiangsu Özel Olarak Atanan Profesör Başlangıç Fonları, Jiangsu Eyaleti’ndeki Altı Yetenek Tepeleri Projesi (Grant No. 2014-SWYY-016) tarafından finanse edilen bir Proje tarafından finansal olarak desteklendi. Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (VeterinerHenhenk) Öncelikli Akademik Program Gelişimi. Biz Flavonoidler HPLC ve MS analizleri için Yangzhou Üniversitesi Test Merkezi teşekkür ederiz.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer’s disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author’s transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
