Biosintesi di un flavonolo da un Flavanone stabilendo una cascata bienzimatica a un vaso
Summary
La derivazione di un flavonolo è fondamentale per la sua applicazione nel settore sanitario e dell’industria alimentare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la biosintesi di un flavonolo da un flavanone e discutiamo i passi cruciali ei suoi vantaggi rispetto ad altri approcci.
Abstract
I flavonomi sono una sottoclasse importante dei flavonoidi con una varietà di attività biologiche e farmacologiche. Qui, forniamo un metodo per la sintesi ezimatica in vitro di un flavonolo. In questo metodo, Atf3h e Atfls1, due geni chiave nel percorso biosintetico dei flavonomi, sono clonati e sovraespressi in Escherichia coli. Gli enzimi ricombinanti vengono purificati tramite una colonna di affinità e quindi una cascata bienzimatica viene stabilita in uno specifico buffer sintetico. Due flavonomi sono sintetizzati in questo sistema come esempi e determinati dalle analisi TLC e HPLC/LC/MS. Il metodo mostra evidenti vantaggi nella derivazione dei flavonoli rispetto ad altri approcci. Si tratta di risparmio di tempo e manodopera e altamente conveniente. La reazione è facile da controllare con precisione e quindi scalare per la produzione di massa. Il prodotto di destinazione può essere purificato facilmente grazie ai semplici componenti del sistema. Tuttavia, questo sistema è di solito limitato alla produzione di un flavonolo da un flavanone.
Introduction
I flavonomi sono una sottoclasse importante dei flavonoidi vegetali e sono coinvolti nello sviluppo e nella pigmentazione delle piante1,2,3. Ancora più importante, questi composti possiedono una vasta gamma di attività per la salute-benefica, come anti-cancro4,5, anti-ossidativo6, anti-infiammatorio7, antiobesità8, anti-ipertensivo9 , e le proprietà di richiamo della memoria10, portando ad un gran numero di studi su questi metaboliti secondari derivati dalle piante. Tradizionalmente, questi composti sono principalmente derivati dall’estrazione delle piante utilizzando solventi organici. Tuttavia, a causa del loro bassissimo contenuto negli impianti11,12,13, il costo di produzione per la maggior parte dei flavonomi rimane elevato, che impone grandi restrizioni sulla loro applicazione nel settore sanitario e alimentare industria.
Nel corso degli ultimi decenni, gli scienziati hanno sviluppato un certo numero di metodi per derivare flavonoidi14,15. Tuttavia, la sintesi chimica di queste molecole complicate possiede una varietà di svantaggi intrinseci16. Richiede non solo reagenti tossici e condizioni di reazione estreme, ma anche molti passi per produrre un composto flavonoide bersaglio14,17. Inoltre, un’altra sfida importante in questa strategia è la sintesi chirale delle molecole flavonoidi attive. Pertanto, non è una strategia ideale per produrre flavonoidi su scala commerciale tramite sintesi chimica16,17.
Recentemente, gli scienziati hanno sviluppato una promettente strategia alternativa per produrre questi complicati composti naturali progettando microbi con un percorso per la biosintesi flavonoide18,19,20, 21 Mieto , 22, che è stato decifrato con successo nelle piante23. Ad esempio, Duan ealtri ha introdotto una via biosintetica nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae per produrre kaempferol (KMF)24. Malla et al. ha prodotto astragalina, un flavonolo glicosillato glicosylato, introducendo i geniflavanone 3-idrossislasi (f3h), la sinteassi di flavonol (fls1) e UDP-glucosioide:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 Escherichia coliBL21(DE3)17. Anche se ci sono un bel po ‘di paradigmi, non tutti i microbi geneticamente ingegnerizzati producono i prodotti di interesse a causa della complessità di una piattaforma cellulare, l’incompatibilità tra elementi genetici artificialmente sintetizzati e ospiti, l’inibitorio effetto dei prodotti di destinazione rispetto alle cellule ospiti e l’instabilità di un sistema cellulare ingegnerizzato stesso16.
Un’altra promettente strategia alternativa per la produzione di flavonoidi è quella di stabilire una cascata multienzimatica in vitro. Cheng et al. hanno riferito che i poliketi enterocin possono essere sintetizzati con successo assemblando un percorso enzimatico completo in un vaso25. Questa strategia sintetica senza cellule aggira le restrizioni di una fabbrica di produzione microbica ed è quindi fattibile per produrre alcuni flavonoidi in grande quantità16.
Recentemente, abbiamo sviluppato con successo un sistema sintetico bienzima per convertire la naringenina (NRN) in KMF in un vaso16. Qui, descriviamo questo sistema in dettagli e i metodi coinvolti nell’analisi dei prodotti. Presentiamo anche due esempi che utilizzano questo sistema per produrre KMF da NRN e quercetina (QRC) da eriodictyol (ERD). Inoltre, discutiamo i passaggi cruciali di questo metodo e le future direzioni di ricerca nella biosintesi dei flavonoidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una serie di studi si concentra sulla derivazione dei flavonomi a causa della loro potenziale applicazione nell’assistenza sanitaria e nell’industria alimentare. Tuttavia, l’estrazione tradizionale delle piante con solventi organici e la sintesi chimica possiedono svantaggi intrinseci, che ne limitano l’uso nella produzione di flavonomi. Qui, riportiamo un metodo dettagliato per produrre un flavonolo da un flavanone in un vaso stabilendo una cascata bienzimatica in vitro. I passaggi critici di questo protocollo sono: 1) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da Yangzhou University Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Jiangsu Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project nella provincia di Jiangsu (Grant no. 2014-SWYY-016), e un progetto finanziato da il programma accademico prioritario sviluppo degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu (medicina veterinaria). Ringraziamo il Testing Center dell’Università di Yangzhou per le analisi HPLC e MS dei flavonoidi.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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