Biosynthèse d'un Flavonol d'un Flavanone par l'établissement d'une cascade bienzymatique d'un pot
Summary
La dérivation d’un flavonol est cruciale pour son application dans les soins de santé et l’industrie alimentaire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la biosynthèse d’un flavonol à partir d’un flavanone et discuter des étapes cruciales et de ses avantages par rapport à d’autres approches.
Abstract
Les flavonols sont une sous-classe majeure de flavonoïdes avec une variété d’activités biologiques et pharmacologiques. Ici, nous fournissons une méthode pour la synthèse enzymatique in vitro d’un flavonol. Dans cette méthode, Atf3h et Atfls1, deux gènes clés dans la voie biosynthétique des flavonols, sont clonés et surexprimés dans Escherichia coli. Les enzymes recombinantes sont purifiées via une colonne d’affinité, puis une cascade bienzymatique est établie dans un tampon synthétique spécifique. Deux flavonols sont synthétisés dans ce système à titre d’exemples et déterminés par des analyses TLC et HPLC/LC/MS. La méthode présente des avantages évidents dans la dérivation des flavonols par rapport à d’autres approches. Il est économique en temps et en main-d’œuvre et très rentable. La réaction est facile à contrôler avec précision et donc à l’échelle pour la production de masse. Le produit cible peut être purifié facilement en raison des composants simples du système. Cependant, ce système est généralement limité à la production d’un flavonol à partir d’un flavanone.
Introduction
Les flavonols sont une sous-classe majeure de flavonoïdes végétaux et sont impliqués dans le développement et la pigmentation des plantes1,2,3. Plus important encore, ces composés possèdent un large éventail d’activités bénéfiques pour la santé, telles que l’anticancéreux4,5, anti-oxydatif6, anti-inflammatoire7, antiobésité8, anti-hypertenseur9 , et les propriétés de rappel de mémoire10, menant à un grand nombre d’études sur ces métabolites secondaires d’origine végétale. Traditionnellement, ces composés sont principalement dérivés de l’extraction végétale à l’aide de solvants organiques. Cependant, en raison de leur très faible teneur en plantes11,12,13, le coût de production pour la plupart des flavonols reste élevé, ce qui impose de grandes restrictions sur leur application dans les soins de santé et l’alimentation industrie.
Au cours des dernières décennies, les scientifiques ont développé un certain nombre de méthodes pour dériver des flavonoïdes14,15. Cependant, la synthèse chimique de ces molécules compliquées possède une variété d’inconvénients intrinsèques16. Il nécessite non seulement des réactifs toxiques et des conditions de réaction extrêmes, mais aussi de nombreuses étapes pour produire un composé flavonoïde cible14,17. En outre, un autre défi important dans cette stratégie est la synthèse chirale des molécules flavonoïdes actives. Par conséquent, ce n’est pas une stratégie idéale pour produire des flavonoïdes à une échelle commerciale via la synthèse chimique16,17.
Récemment, les scientifiques ont développé une stratégie alternative prometteuse pour produire ces composés naturels compliqués par l’ingénierie des microbes avec une voie pour la biosynthèse flavonoïde18,19,20, 21 Ans, états-unis , 22, qui a été déchiffré avec succès dans les plantes23. Par exemple, Duan et coll. ont introduit une voie biosynthétique dans la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae pour produire du kaempferol (KMF)24. Malla et coll. ont produit de l’astragaline, un flavonol glycosylated, en introduisant laflavanone 3-hydroxylase (f3h),la synthase flavonol (fls1), et UDP-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 gènes dans Escherichia coliBL21(DE3)17. Même s’il existe pas mal de paradigmes, tous les microbes génétiquement modifiés ne produisent pas les produits d’intérêt en raison de la complexité d’une plate-forme cellulaire, de l’incompatibilité entre les éléments génétiques synthétisés artificiellement et les hôtes, l’inhibiteur l’effet des produits cibles contre les cellules hôtes, et l’instabilité d’un système cellulaire conçu lui-même16.
Une autre stratégie alternative prometteuse pour la production de flavonoïdes est d’établir une cascade multienzymatique in vitro. Cheng et coll. ont signalé que les polycécides d’entérocine peuvent être synthétisés avec succès en assemblant une voie enzymatique complète dans un pot25. Cette stratégie synthétique sans cellules contourne les restrictions d’une usine de production microbienne et est donc possible pour produire des flavonoïdes en grande quantité16.
Récemment, nous avons développé avec succès un système synthétique bienzyme pour convertir la naringenine (NRN) en KMF dans un pot16. Ici, nous décrivons ce système en détail et les méthodes impliquées dans l’analyse des produits. Nous présentons également deux exemples qui utilisent ce système pour produire KMF à partir de NRN et de quercétine (QRC) à partir d’ériodictyol (ERD). En outre, nous discutons des étapes cruciales de cette méthode et des orientations futures de recherche dans la biosynthèse des flavonoïdes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un certain nombre d’études portent sur la dérivation des flavonols en raison de leur application potentielle dans l’industrie des soins de santé et de l’alimentation. Cependant, l’extraction végétale traditionnelle à l’aide de solvants organiques et de synthèse chimique possède des inconvénients intrinsèques, qui limitent leur utilisation dans la production de flavonols. Ici, nous rapportons une méthode détaillée pour produire un flavonol à partir d’un flavanone dans un pot en établissant une cascade bienz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par l’Université de Yangzhou Spécialement nommé Professeur Fonds de démarrage, Jiangsu Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project dans la province du Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016), et un projet financé par le programme académique prioritaire de développement des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (médecine vétérinaire). Nous remercions le Centre de test de l’Université de Yangzhou pour les analyses HPLC et MS des flavonoïdes.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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