Стратегия по выявлению соединений, влияющих на рост клеток и выживаемость в культурных клетках млекопитающих при низкой до умеренной пропускной связи
Summary
Часто необходимо оценить потенциальную цитотоксичность набора соединений на культивированных клетках. Здесь мы описываем стратегию надежного скрининга токсичных соединений в формате 96 скважин.
Abstract
Цитотоксичность является критическим параметром, который должен быть количественно при изучении препаратов, которые могут иметь терапевтические преимущества. Из-за этого, многие анализы скрининга наркотиков использовать цитотоксичность в качестве одной из критических характеристик, которые будут профилированы для отдельных соединений. Клетки в культуре являются полезной моделью для оценки цитотоксичности, прежде чем приступить к последующей деятельности по перспективным свинца соединений в более дорогостоящих и трудоемких моделей животных. Мы описываем стратегию по выявлению соединений, которые влияют на рост клеток в tdTomato, выражающей линию стволовых клеток человека (NSC). Стратегия использует два дополнительных анализа для оценки числа клеток. Один асссеработает работает через уменьшение 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-дифениltэттрацололий бромид (МТТ) в formazan в качестве прокси для номера ячейки, а другой непосредственно рассчитывает tdTomato выражая NSCs. Два анализа могут быть выполнены одновременно в одном эксперименте и не являются трудоемкими, быстрыми и недорогими. Стратегия, описанная в этой демонстрации, протестировала 57 соединений на исследовательском первичном экране на токсичность в 96-колодцном формате пластины. Три из хитов были охарактеризованы далее в шести точках доза ответ с использованием той же настройки ассея, как основной экран. В дополнение к обеспечению отличного подтверждения токсичности, сравнение результатов двух анализов может быть эффективным в выявлении соединений, влияющих на другие аспекты роста клеток.
Introduction
Одной из наиболее важных характеристик, которая должна быть определена для химического соединения, которое имеет терапевтический потенциал является его токсичность для клеток животных. Эта характеристика будет определять, является ли препарат хорошим кандидатом для более обширного исследования. В большинстве случаев, соединения с минимальной токсичностью ищутся, но Есть ситуации, в которых соединение с возможностью убить конкретных типов клеток представляет интерес, например, противоопухолевые препараты. Хотя целые животные являются лучшими модельными системами для определения системной токсичности, затраты и рабочая сила, связанные с этим, являются непомерно высокими, когда необходимо протестировать более нескольких соединений. Как таковой культуры клеток млекопитающих, как правило, используется в качестве наиболее эффективной альтернативой1,2. Малые и средние экраны пропускной способностью наркотиков являются важным способом, с помощью которого токсичность может быть оценена в культуре клеток. Эти экраны могут быть использованы для допроса аннотированных библиотек, ориентированных на отдельные сигнальные пути. Общий формат такого экрана заключается в том, чтобы сначала проверить все соединения в библиотеке в одной дозе (как правило, 10 мкм) в исследовательском первичной токсичности экрана, а затем выполнить углубленный вторичный экран реакции дозы, чтобы полностью охарактеризовать токсичность профиль хитов с основного экрана. Методы реализации этой стратегии будут описаны здесь и обеспечивают быстрый, эффективный и недорогой способ выявления и характеристики токсичных соединений.
Несколько методов были разработаны для оценки цитотоксичности малых соединений и наноматериалов в клетках млекопитающих3,4. Следует отметить, что некоторые материалы могут взаимодействовать с проверкой, обеспечивающей вводящие в заблуждение результаты, и такие взаимодействия должны быть проверены при характеристике хитов от токсичности экранов4. Анализы цитотоксичности включают trypan синий исключение5,лактат дегидрогеназы (LDH) релиз анализ6, Аламар синий анализ7, кальцийет ацетоксиметил эфир (AM)8, и АТФ анализ9. Все эти анализы измеряют различные аспекты клеточного метаболизма, которые могут служить прокси для номера ячейки. В то время как все предлагают преимущества, тетразолий соли на основе assays, таких как 3-(4,5-диметилтизол-2-yl)-2,5-дифенилтетрацололий бромид (MTT), 2,3-бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофени)-2H-тетролийт-5-5-car-2 и 4-(3-4- Иодофенил-2-4-нитрофенил-2H-5-тетразолио)-1,3-бензола дисульфоната (WST-1)10,11 обеспечивают хорошую точность и простоту использования при низкой цене. MTT, который будет использоваться в этой демонстрации, сводится к нерастворимым formazan митохондриальной редуктазы и скорость этого преобразования сильно коррелирует с номером ячейки. Этот анализ регулярно используется как в небольших масштабах, так и для скрининговых библиотек с до 2000 соединений12. Прямой подсчет клеток по маркированному маркеру предлагает другой метод оценки клеточного числа, и в отличие от mtT-оценки он может предоставить дополнительную информацию о динамике клеточного роста. Несколько общедоступных алгоритмов доступны для выполнения автоматизированного анализа количества клеток и Есть также собственные алгоритмы, которые являются частью пакетов программного обеспечения для изображений читателей13,14. В этом описании метода, человеческая нейронная стволовая клетка (NSC) линия, которая была генетически отредактирована, чтобы составно выразить tdTomato15 будет служить в качестве тестовой линии для сравнения результатов клеточной жизнеспособности между MTT анализ и автоматизированный подсчет клеток анализ на экране оценки токсичности 57 испытательных соединений. Хотя основная цель этой стратегии заключалась в выявлении и характеристике токсичных соединений, она имеет дополнительное преимущество потенциального выявления ингибирующих и растущих соединений, усиливающих соединения и тем самым обеспечивающих эффективный метод идентификации лекарств которые могут модулировать клеточный рост.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основная цель этой статьи состояла в том, чтобы описать стратегию, которая могла бы эффективно и недорого определить соединения, влияющие на рост клеток в низкой и умеренной пропускной связи скрининга. Два ортогоналовых метода были использованы для оценки числа клеток, чтобы повысить ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Программой интрамуральных исследований NINDS.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
