HıV-1 çoğaltma sırasında devir Immünoplikasyon ve kütle spektrometresi yoluyla Nüklenolar faktörleri tanımlaması

Nükl, viral replikasyon için gerekli çeşitli hücresel ev sahibi ve viral faktörlerin etkileşim zemin olarak öne olduğunu. Nükleyer, üç farklı bölmeye bölünmüş kompleks bir yapıdadır: fibriler bölmesi, yoğun fibriler bölmesi ve granüler bölme. HıV-1 Rev proteini özellikle granüler bölmeler içinde lokalleştirir; Ancak, bu yerelleştirme deseni nedeni bilinmiyor. Nols dizisi içinde tek noktalı mutasyonların varlığını (Rev mutasyonlar 4, 5, ve 6), Rev bir nükle desen korur ve daha önce HIV-1_HXB2 çoğaltma kurtarmak için gösterilmiştir, ancak, daha düşük verimlilik ile karşılaştırıldığında WT Rev¹ . Tüm tek nokta mutasyonlar HıV-1_NL4-3 bulaşıcı döngüsü sürdürmek mümkün değildir. NoLS dizisi içinde birden çok tek noktalı mutasyonlar varlığında (Rev-NoLS mutasyonları 2 ve 9), Rev çekirdek ve sitoplazması boyunca dağıtmak için gözlenen ve HıV-1_HXB2 çoğaltma¹kurtarmak mümkün olmamıştır. Bu proteomik çalışmanın amacı, nükselolar yanı sıra, Rev-aracılı HıV-1 bulaşıcı yolunda yer alan nonnüktrinolar hücresel faktörleri deşifre etmektir. Rev immünopyemek koşulları, nüklenolar B23 phosphoprotein ile etkileşimi ile optimize edilmiştir, daha önce nükloon mutasyonların varlığında Rev ile etkileşimi kaybetmek gösterilmiştir.

Rev hücresel faktörler yoğun geçmişte incelenmiştir; Ancak, bu viral patogenezi yokluğunda yapıldı. Bir protein, özellikle, bu çalışmada HIV-1 çoğaltma sırasında Rev etkileşimi ile karakterize nükvolar fosfoprotein B23-aynı zamanda nucleophosmin (NPM), numatrin veya NO38 amfitolit²,³ olarak adlandırılır ⁴. B23 üç isoformlar olarak ifade edilir (NPM1, NPM2, ve NPM3)-tüm üyeleri nucleophosmin/nükleoplazmin nükleer refakatçi aile^5,6. NPM1 moleküler refakatçi, nüklozomların uygun montajında, kromatin yüksek sıralı yapılarında yer alan protein/nüklik asit kompleksleri oluşumunda,^7,8ve toplama önlenmesi ve hedef proteinlerin N-terminal çekirdek etki alanı (kalıntıları 1-120)⁹ile yanlış katlanması. NPM1 işlevselliği çekirdek ve sitoplazması arasında preribosomal partiküllerin taşınması ile ribozom Genesis uzanır^10,11, dahili transkripsiyonu spacer serisindeki ^{preribosomal RNA işlenmesi 12},¹³, ve ribozomal montaj sırasında proteinlerin nüklolar toplama tutuklama^14,15. NPM1 apoptozis inhibisyonu içinde bulaşmış¹⁶ ve tümör bastırıcı arf stabilizasyonu^17,18 ve p53¹⁹, bir Onkojenik faktör ve tümör bastırıcı olarak ikili rolünü açığa. NPM1 genom stabilitesi, centrosome çoğaltma ve transkripsiyon hücresel faaliyetlerine katılır. NPM1, hücre döngüsü interfaz sırasında nükleollerde, mitozis sırasında kromozomal çevre boyunca ve mitozun sonucu olarak prenüsolar gövdelere (PNB) bulunur. NPM2 ve NPM3 malignite sırasında değiştirilmiş ifade seviyeleri uğrar NPM1 olarak iyi çalışılmıştır değildir²⁰.

NPM1, iç NES ve NLS^9,21 ve daha önce HIV-1 tat ve Rev proteinleri nükleer ithalatı sürücü bildirilmiştir çeşitli nükleer/nükleolar proteinlerin nükleoplazmik mekik belgelenmiş. B23-bağlayıcı-Domain-β-galactosidase Fusion proteinlerin varlığında, tat Sitoplazmanın içinde mislocalizes ve Transaktivasyon etkinliğini kaybeder; Bu B23²için tat güçlü bir benzeşimi gösterir. Başka bir çalışmada RRE içeren mRNAs yokluğunda bir Rev/B23 istikrarlı kompleks kuruldu. RRE mRNA huzurunda, Rev B23 dan ayrışıp ve tercihen HIV RRE bağlar, B23²²deplasmanında lider. Nerede, subnuclear düzeyinde, tat transaktivasyonu ve B23 HIV mRNA için Rev değişim süreci gerçekleşir bilinmiyor. Her iki protein B23 etkileşimi ile aynı anda nükolus girmek için öne vardır. Diğer ev sahibi hücresel proteinlerin HıV nükselolar yolu içinde katılımı bekleniyor. Bu proteomik soruşturmada açıklanan yöntemler, HıV-1 patogenezi sırasında yer alan hücre faktörleri ile nükselolus ‘un etkileşimlerine yardımcı olacaktır.

Proteomik soruşturma, HıV-1_HXB2 üretimi Için Rev nols tek noktalı mutasyonlar (M4, M5 ve M6) ve birden fazla arginin değiştirme (m2 ve M9) ifadesi ile başlatıldı. Bu modelde, bir hela hücre hattı stabil Rev eksikliği HIV-1_HXB2 (hlfb) WT Rev ve Rev nüklemler mutasyonlar 3 ‘ End bir bayrak etiketi içeren transfekte olduğunu ifade ediyor. WT Rev varlığı HLfB kültüründe, Rev eksikliği (m2 ve M9) kurtarmak değil Rev-NoLS mutasyonlar ile karşılaştırıldığında, viral replikasyon gerçekleşmesi için izin verecektir veya viral çoğaltmanın gerçekleşmesi için izin verir, ancak gibi verimli WT Rev (M4, M5, ve M6)¹. Cell lysate, Rev ifadesinin varlığında viral proliferasyon sonrası ve Rev/B23 etkileşimi için optimize edilmiş bir liziz tamponu ile immünopresipitasyon ‘a maruz kaldıktan sonra 48 h alınır. Değişken tuz konsantrasyonlarını kullanarak lizis tampon optimizasyonu açıklanmıştır ve HıV-1 Rev için protein elüsyon yöntemleri gümüş lekeli veya Coomassie-vitray-sayfa jeller içinde karşılaştırılır ve analiz edilir. İlk proteomik yaklaşımı, tandem kütle spektrometresi tarafından ifade edilen WT Rev, m2, M6 ve M9 tarafından el ile oluşturulan bir numunenin doğrudan analizini içerir. WT Rev, M4, M5 ve M6 ‘ın atlatılacağı ikinci bir yaklaşım, ilk yaklaşımla karşılaştırıldığında bir jel ekstraksiyon işlemi uygulandı. WT Rev ile karşılaştırıldığında Rev-NoLS mutasyonları peptid yakınlık analiz edilir ve protein tanımlama olasılığı görüntülenir. Bu yaklaşımlar, HIV-1 mRNA taşımacılığında ve Rev ile HıV-1replikasyon sırasında birleştirme sürecinde bulunan olası faktörleri (nüklerolar ve nonnüklerolar) ortaya çıkarır. Genel olarak, hücre lizis, IP, açıklanan ve elüsyon koşulları, enfeksiyon yollarını etkinleştirmek ve düzenleyen ana hücresel faktörlerin anlaşılması için ilgi viral proteinlere uygulanabilir. Bu da çeşitli hastalık modellerinin Kalıcılık için gerekli hücresel ana faktör çalışması için geçerlidir. Bu proteomik modelde, HıV-1 Rev IP, nükle sitoplazmik mekik aktivitesi ve HıV-1 mRNA bağlayıcılığı ile ilgili olarak B23 etkileşim için optimize edilmiştir. Ayrıca, hücre hatları stabil ilgi anahtar proteinlerin eksiktir bulaşıcı hastalık modelleri ifade, HLfB hücre hattına benzer, ilgi bulaşıcı yollar çalışmak için geliştirilebilir.