Идентификация нуклеолярных факторов во время репликации ВИЧ-1 через Rev Immunoprecipitation и масс-спектрометрию

Ядро постулируется как место взаимодействия различных клеточных хостов и вирусных факторов, необходимых для репликации вируса. Ядро представляет собой сложную структуру, разделенную на три различных отсека: фибриллярный отсек, плотный фибриллярный отсек и гранулированный отсек. Белок ВИЧ-1 Rev локализуется специально в гранулированных отсеках; однако причина такой схемы локализации неизвестна. При наличии одноточечных мутаций в последовательности NoLS (Rev мутации 4, 5 и 6), Rev поддерживает нуклеолярную модель и ранее было показано, чтобы спасти ВИЧ-1_HXB2 репликации, однако, с пониженной эффективностью по сравнению с WT Rev¹ . Все одноточечные мутации не в состоянии поддерживать инфекционный цикл ВИЧ-1_NL4-3. При наличии нескольких одноточечных мутаций в последовательности NoLS (Rev-NoLS мутации 2 и 9), Rev наблюдается разойтись по всему ядру и цитоплазмы и не смог спасти ВИЧ-1_HXB2 репликации¹. Цель этого исследования протеомики заключается в расшифровке нуклеолярных, а также ненуклеолярных клеточных факторов, участвующих в инфекционном пути, опосредоваваемом ВИЧ-1. Условия иммунопреципатации оптимизированы при взаимодействии с нуклеолярным фосфопротеим B23, который ранее был показан, чтобы потерять взаимодействие с Rev в присутствии нуклеолярных мутаций.

Rev клеточных факторов были широко изучены в прошлом; однако это было сделано при отсутствии вирусного патогенеза. Один белок, в частности, что характеризуется в этом исследовании через Rev взаимодействия во время репликации ВИЧ-1 является нуклеолярный фосфопротеин B23 – также называемый нуклеофосмиин (NPM), numatrin, или NO38 в амфибий^{2,3, 4}. B23 выражается как три изоформы (NPM1, NPM2, и NPM3) – все члены нуклеофосмина / нуклеоплазмина ядерного сопровождающего семейства^5,6. Молекулярный сопровождающий NPM1 функционирует при надлежащей сборке нуклеосом, в формировании белково-нуклеиновых кислотных комплексов, участвующих в структурах высшего порядка хроматина^7,8,и в профилактике агрегации и неправильное сворачивание целевых белков через n-терминальный ядерный домен (остатки 1-120)⁹. Функциональность NPM1 распространяется на рибосомный генезис через транспортировку прерибосомных частиц между ядром и цитоплазмой^10,11, обработка прейбосомальной РНК во внутренней транскрибированной последовательности ^{прокладки 12,13}, и арест нуклеолярной агрегации белков во время рибосомной сборки^14,15. NPM1 вовлечен в ингибирование апоптоза¹⁶ и в стабилизацию опухолевых супрессоров ARF^17,18 и p53^19,раскрывая свою двойную роль в качестве онкогенного фактора и супрессора опухоли. NPM1 участвует в клеточной деятельности стабильности генома, центросомного репликации и транскрипции. NPM1 содержится в нуклеоли во время межфазы клеточного цикла, вдоль хромосомной периферии во время митоза, и в пренуклеолярных телах (PNB) при заключении митоза. NPM2 и NPM3 не так хорошо изучены, как NPM1, который подвергается изменению уровня экспрессии при злокачественности²⁰.

NPM1 документируется в нуклеоцитоплазматических челночных различных ядерных / нуклеолярных белков через внутренние РЭШ и NLS^9,21 и ранее сообщалось, чтобы диск ядерного импорта ВИЧ-1 Тат и Rev белков. В присутствии B23-связывающего домена-я-галактосидазных термоядерных белков, Тат неправильно локализует в цитоплазме и теряет трансактивационную активность; это демонстрирует сильную близость Тат для B23². Другое исследование установило Rev/B23 стабильный комплекс в отсутствие RRE-содержащих мРНК. В присутствии RRE mRNA, Rev отделяется от B23 и связывает предпочтительно к ВИЧ RRE, что приводит к смещению B23²². Неизвестно, где на субядерном уровне происходит Таттрансактивация и процесс обмена В23 на ВИЧ-мРНК. Оба белка постулируются для ввода ядра одновременно через Взаимодействие B23. Ожидается вовлечение других клеточных белков хозяина в нуклеолярный путь ВИЧ. Методы, описанные в этом исследовании протеомики, помогут выяснить взаимодействие ядра с клеточными факторами хозяина, участвующими во время патогенеза ВИЧ-1.

Исследование протеомики было начато с помощью выражения одноточественных мутаций Rev NoLS (M4, M5 и M6) и нескольких замен аргинина (M2 и M9) для производства ВИЧ-1_HXB2. В этой модели, HeLa клеточной линии устойчиво выражая Rev-дефицитНЫХ ВИЧ-1_HXB2 (HLfB) трансфицируется WT Rev и Rev нуклеолярных мутаций, содержащих тег флага в 3’end. Присутствие WT Rev позволит вирусной репликации происходит в культуре HLfB, по сравнению с Rev-NoLS мутаций, которые не спасти Rev дефицита (M2 и M9), или позволяют вирусной репликации происходит, но не так эффективно, как WT Rev (M4, M5, и M6)¹. Лизат клетки собран 48 h более поздно после вирусного пролиферации в присутствии выражения Rev и подвергся к immunoprecipitation с буфером lysis оптимизированным для взаимодействия Rev/B23. Описывается оптимизация буфера лизиса с использованием различных концентраций соли, а методы элюционизации белка для ВИЧ-1 Rev сравниваются и анализируются в окрашенных серебром или комасси-окрашенных гелях SDS-PAGE. Первый подход протеомики включает в себя прямой анализ элетативной выборки из выраженных WT Rev, M2, M6 и M9 тандемной масс-спектрометрией. Второй подход, при котором улеты WT Rev, M4, M5 и M6 прошли процесс извлечения геля, сравнивается с первым подходом. Пептид сродство к Rev-NoLS мутаций по сравнению с WT Rev анализируется и вероятность идентификации белка отображается. Эти подходы выявляют потенциальные факторы (нуклеолярные и ненуклеолярные), которые участвуют в транспортировке ВИЧ-1 мРНК и сращивания с Rev во время репликации ВИЧ-1. В целом, описанные условия клеточного лиза, ИС и элуции применимы к вирусным белкам, представляющим интерес для понимания клеточных факторов хозяина, которые активируют и регулируют инфекционные пути. Это также применимо к изучению клеточных факторов хозяина, необходимых для сохранения различных моделей заболеваний. В этой модели протеомики, ВИЧ-1 Rev IP оптимизирован для взаимодействия B23 для выяснения нуклеолярных факторов, участвующих в нуклеотипитопасмической челночной деятельности и связывания ВИЧ-1 мРНК. Кроме того, можно разработать клеточные линии, четко выражающие модели инфекционных заболеваний, которые не достаточны для ключевых белков, представляющих интерес, подобно линии клеток HLfB, для изучения инфекционных путей, представляющих интерес.