Summary

REV免疫沈殿と質量分析によるHIV-1複製中のヌクレオール因子の同定

Published: June 26, 2019
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Summary

ここでは、質量分析のためのHIV-1複製の存在下でのRev免疫沈殿について説明する。記載された方法は、HIV-1感染サイクルに関与するヌクレオラー因子の同定に使用することができ、研究中の経路の特徴付けのための他の疾患モデルに適用可能である。

Abstract

HIV-1感染サイクルは、ウイルスの複製、包装、および放出を容易にするために、宿主因子とのウイルスタンパク質相互作用を必要とする。感染サイクルはさらに、スプライシングを調節し、ヌクレオサイトプラズム輸送を可能にするために、HIV-1 RNAを用いたウイルス/宿主タンパク質複合体の形成を必要とする。HIV-1 Revタンパク質は、イントロニックシス-作用型標的-Rev応答元素(RRE)との多層化を通じてHIV-1 mRNAの核輸出を達成する。核色の局在シグナル(NoLS)は、Revアルギニン豊富なモチーフ(ARM)のCOOH終位内に存在し、核内のRev/RRE複合体の蓄積を可能にする。核因子因子は、mRNAに依存しない核輸出およびスプライシングを媒介することに加えて、様々な他の機能を通じてHIV-1感染サイクルをサポートすると推測される。質量分析のためのHIV-1複製の存在下で、Revヌクレオラー変異(欠失および単一点Rev-NoLS変異)と比較して、野生型(WT)Revの免疫沈殿法について述べるとよ。ヌクレオ細胞性輸送に関与するヌクレオロール因子(ヌクレオホスミンB23およびヌクレオリンC23)ならびに細胞スプライシング因子は、Rev-NoLS変異の存在下でRevとの相互作用を失う。snoRNA C/Dボックス58のような様々な他の核因子は、Rev変異との相互作用を失うことが同定されるが、HIV-1複製サイクルにおけるその機能は未知のままである。ここで提示された結果は、HIV-1感染サイクルを維持するウイルス/宿主ヌクレオロール因子の同定にこのアプローチを使用することを示す。このアプローチで使用される概念は、研究中の経路の特性を必要とする他のウイルスおよび疾患モデルに適用可能である。

Introduction

核は、ウイルス複製に必要な様々な細胞宿主およびウイルス因子の相互作用場として仮定される。核は3つの異なったコンパートメントに細分される複雑な構造である:フィブリラコンパートメント、密な線維のコンパートメントおよび粒状コンパートメント。HIV-1 Revタンパク質は、粒状コンパートメント内で特異的に局所化します。ただし、このローカリゼーション パターンの理由は不明です。NoLS配列(Rev突然変異4、5、および6)内に単一点突然変異が存在する場合、Revは核パターンを維持し、以前にHIV-1HXB2複製を救出することが示されているが、WT Rev 1と比較して効率が低下した。.すべての単一点突然変異は、HIV-1NL4-3感染サイクルを維持することができません。NoLS配列内の複数の単一点突然変異(Rev-NoLS突然変異2および9)の存在下で、Revは核および細胞質全体に分散することが観察され、HIV-1HXB2複製1を救出することができませんでした。このプロテオミクス研究の目的は、Rev媒介性HIV-1感染経路に関与するヌクレオラーおよび非ヌクレオロール細胞因子を解読することです。Rev免疫沈殿条件は、ヌクレオラーB23リンタンパク質との相互作用を通じて最適化され、以前にヌクレオラー変異の存在下でRevとの相互作用を失うことが示されている。

Rev細胞因子は、過去に広範囲に研究されています。しかし、これはウイルス病因の不在で行われている。特に、HIV-1複製中のRev相互作用を介して本研究で特徴付けられた1つのタンパク質は、両生類2、3、両生類におけるヌクレオホスミン(NPM)、ヌマトリン、またはNO38とも呼ばれるヌクレオホスミンB23である。4.B23は、3つのアイソフォーム(NPM1、NPM2、およびNPM3)として表される- 核核ホスミン/核オプラスミン核シャペロンファミリー5、6の全メンバー。NPM1分子シャペロンは、ヌクレオソームの適切な組み立てにおいて、クロマチン高次構造7、8に関与するタンパク質/核酸複合体の形成において、および凝集の防止において機能し、N末端コアドメインを介した標的タンパク質の誤折(残渣1-120)9.NPM1機能は、核と細胞質間のプリリボソーム粒子の輸送を通じてリボソーム発生にまで及び、内部転写スペーサー配列におけるプリリボソームRNAの処理12,13,リボソームアセンブリ14,15の間にタンパク質の核凝集を逮捕する.NPM1は、アポトーシス16の阻害および腫瘍抑制剤ARF 17、18およびp5319の安定化に関与し、発生因子および腫瘍抑制剤としての二重の役割を明らかにする。NPM1は、ゲノム安定性、セントロソーム複製、転写の細胞活動に関与する。NPM1は、細胞周期間相中のヌクレオリ、有人化時の染色体周辺、および有分裂の終わりに核前核体(PNB)に見出される。NPM2およびNPM3は、悪性腫瘍20の間に発現レベルの変化を受けるNPM1ほどよく研究されていない。

NPM1は、内部ファミコンおよびNLS 9、21を介した様々な核/核系タンパク質の核細胞質シャトルに記載されており、HIV-1タットおよびRevタンパク質の核輸入を促進することが以前に報告されている。B23-結合ドメイン-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質の存在下で、タットは細胞質内で誤局在化し、トランス活性化活性を失う。これはB232のためのタットの強い親和性を示す。別の研究は、RRE含有mRNAの不在でRev/B23安定複合体を確立した。RRE mRNAの存在下で、RevはB23から解離し、好ましくはHIV RREに結合し、B2322の変位を引き起こす。核レベルでは、HIV mRNAに対するB23のタットトランス活性化およびRev交換プロセスがどこで起こるかは不明である。両方のタンパク質は、B23相互作用を介して同時に核に入ると仮定される。HIV核経路における他の宿主細胞タンパク質の関与が期待される。このプロテオミクス調査に記載されている方法は、HIV-1病因の間に関与する宿主細胞因子との核の相互作用を解明するのに役立つ。

プロテオミクス調査は、HIV-1HXB2産生に対するRev NoLS単点変異(M4、M5、およびM6)および複数のアルギニン置換(M2およびM9)の発現を通じて開始された。このモデルでは、Rev欠損HIV-1HXB2(HLfB)を安定的に発現するHeLa細胞株を、3’末端にフラグタグを含むWT RevおよびRevヌクレオラー変異でトランスフェクトする。WT Revの存在は、Rev欠乏症(M2およびM9)を救済しないRev-NoLS変異と比較して、HLfB培養においてウイルス複製が起こることを可能にする、またはウイルス複製がWT Rev(M4、M5、およびM6)1ほど効率的に起こらないことを可能にする。細胞リサートは、Rev発現の存在下でウイルス増殖後48時間後に収集され、Rev/B23相互作用用に最適化されたリシスバッファーを用いて免疫沈殿を行った。様々な塩濃度を用いた溶解バッファー最適化について説明し、HIV-1 Revのタンパク質溶出方法を銀染色またはクマシー染色SDS-PAGEゲルで比較・分析する。最初のプロテオミクスアプローチは、タンデム質量分析による発現WT Rev、M2、M6、およびM9からの放出サンプルの直接分析を含む。WT Rev、M4、M5、およびM6の溶出をゲル抽出プロセスを受けた第2のアプローチを、第1のアプローチと比較する。WT Revと比較してRev-NoLS変異に対するペプチド親和性を分析し、タンパク質同定確率を表示する。これらのアプローチは、HIV-1 mRNA輸送およびHIV-1複製中のRevとのスプライシングに関与する潜在的な因子(ヌクレオールおよび非ヌクレオラー)を明らかにする。全体的に、記載された細胞溶解、IP、および溶出条件は、感染経路を活性化および調節する宿主細胞因子の理解のために目的とするウイルスタンパク質に適用可能である。これは、様々な疾患モデルの持続性に必要な細胞宿主因子の研究にも適用可能である。このプロテオミクスモデルでは、HIV-1 Rev IPは、核細胞質シャトル活性およびHIV-1 mRNA結合に関与するヌクレオロール因子を解明するためにB23相互作用用に最適化されています。さらに、目的の主要タンパク質に欠乏している感染症モデルを安定的に発現する細胞株は、HLfB細胞株と同様に、目的とする感染経路を研究するために開発することができる。

Protocol

1. 細胞培養 10%の胎児ウシ血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、および1mMのピルビン酸ナトリウムを組織培養処理100mmプレート内で補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でHLfBを維持する。5%CO2で供給される加湿インキュベーターで37 °Cで細胞培養物を保つ。1 x 106細胞/mLの細胞密度への通過コンフルエント細胞。 細胞培養培養培養を破棄します。1xリン酸緩衝生理食…

Representative Results

様々な細胞下局在パターンに対応するRev-NoLSの単一および多点アルギニン変異は、WT Rev.WT Rev-3’フラグおよびp cDNA-flagと比較して細胞宿主因子と相互作用する能力において検討された。ベクターはHLfB培養において発現した。タンパク質複合体を全細胞リサートから処理し、銀染色試薬で染色した。Rev-NoLS-3’フラグは、図1のNaCl(137 mM、200mM、および300mM)の様々な濃度を…

Discussion

HIV-1の存在下でRev-NoLS変異とWT Revを比較した質量分析は、ウイルス複製サイクルに関与するヌクレオロール因子を理解するために評価された。これは、ウイルス感染に必要なヌクレオラー成分を同定するであろう。ヌクレオラーB23はRev-NoLSに対して高い親和性を有し、Rev3およびRev結合HIV mRNA22のヌクレオ細胞局在化における機能を有する。単一または複数の?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、国立衛生研究所(NIH)エイズ研究・参照試薬プログラム、エイズ部門、国立アレルギー・感染症研究所が提供するHLfB付着培養のためのバーバラ・K・フェルバー博士とジョージ・N・パヴラキス博士を認めます。病気 (NIAID), NIH.著者らはまた、NIH、助成金AI042552とAI029329によって提供される財政源を認めます。

Materials

Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

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