Identifizierung von Nukleolar-Faktoren während der HIV-1-Replikation durch Rev-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie

Der Nucleolus wird als Interaktionsgrund verschiedener zellulärer Wirts- und Virusfaktoren postuliert, die für die Virusreplikation erforderlich sind. Der Nucleolus ist eine komplexe Struktur, die in drei verschiedene Fächer unterteilt ist: das Fibrillarfach, das dichte Fibrillarfach und das Körnungsfach. Das HIV-1 Rev-Protein lokalisiert sich spezifisch in körnigen Kompartimenten; Der Grund für dieses Lokalisierungsmuster ist jedoch unbekannt. In Gegenwart von Einpunktmutationen innerhalb der NoLS-Sequenz (Rev-Mutationen 4, 5 und 6) behält Rev ein Nukleolar-Muster bei und hat sich zuvor gezeigt, dass es die HIV-1-HXB2-Replikation mit reduzierter Effizienz im Vergleich zu WT Rev ^{1 rettet.} . Alle Einpunktmutationen sind nicht in der Lage, den HIV-1 NL4-3-Infektionszyklus aufrechtzuerhalten. In Gegenwart mehrerer Einzelpunktmutationen innerhalb der NoLS-Sequenz (Rev-NoLS-Mutationen 2 und 9) wurde beobachtet, dass Rev sich im gesamten Kern und Zytoplasma verteilte und nicht in der Lage war, die HIV-1_{HXB2-Replikation} ¹zu retten. Das Ziel dieser Proteomik-Studie ist es, Nukleolar sowie nichtnukleolarzelluläre Faktoren zu entschlüsseln, die am Rev-vermittelten HIV-1-Infektionsweg beteiligt sind. Rev Immunpräzipitationsbedingungen werden durch Interaktion mit dem Nukleolar B23 Phosphoprotein optimiert, das zuvor gezeigt hat, dass Die Wechselwirkung mit Rev in Gegenwart von Nukleolar-Mutationen zu verlieren.

Rev zelluläre Faktoren wurden in der Vergangenheit ausgiebig untersucht; Dies wurde jedoch ohne virale Pathogenese getan. Ein Protein, das in dieser Studie durch Rev-Interaktion während der HIV-1-Replikation charakterisiert wird, ist das Nukleolarphosphoprotein B23 – auch Nucleophosmin (NPM), Numatrin oder NO38 bei Amphibien^{2,3, 4}. B23 wird als drei Isoformen (NPM1, NPM2 und NPM3) ausgedrückt – alle Mitglieder der Nucleophosmin/Nukleoplasmin-Kernchaperonfamilie^5,6. Das Molekularchaperon NPM1 funktioniert bei der richtigen Montage von Nukleosomen, bei der Bildung von Protein-/Nukleinsäurekomplexen, die an Chromatin-Strukturen höherer Ordnung^7,8, und bei der Verhinderung von Aggregation und Fehlfaltung von Zielproteinen durch eine N-Terminal-Kerndomäne (Rückstände 1-120)⁹. Die NPM1-Funktionalität erstreckt sich auf die Ribosomen-Genese durch den Transport von präribosomalen Partikeln zwischen Dem Nucleus und Demonplasma^10,11, die Verarbeitung von präribosomaler RNA in der internen transkribierten Abstandssequenz ^12,13, und die Nukleolar-Aggregation von Proteinen während der ribosomalen Montage^14,15. NPM1 ist in die Hemmung der Apoptose¹⁶ und in die Stabilisierung der Tumorsuppressoren ARF^17,18 und p53¹⁹verwickelt, was seine Doppelrolle als onkogener Faktor und Tumorsuppressor offenbart. NPM1 beteiligt sich an den zellulären Aktivitäten der Genomstabilität, Zentromatreplikation und Transkription. NPM1 findet sich in Nukleoli während der Zellzyklus-Interphase, entlang der chromosomalen Peripherie während der Mitose und in pränukleolaren Körpern (PNB) am Ende der Mitose. NPM2 und NPM3 sind nicht so gut untersucht wie NPM1, das während der Malignität²⁰veränderte Expressionsniveaus durchläuft.

NPM1 ist in der nukleozytoplasmatischen Abschaltung verschiedener Kern-/Nukleolar-Proteine durch ein internes NES und NLS^9,21 dokumentiert und wurde zuvor berichtet, dass sie den nuklearen Import von HIV-1-Tat- und Rev-Proteinen vorantreiben. In Gegenwart von B23-bindungs-Domain–Galactosidase-Fusionsproteinen, Tat misslokalisiert innerhalb des Zytoplasmas und verliert Transaktivierungsaktivität; dies zeigt eine starke Affinität von Tat für B23². Eine andere Studie stellte einen Rev/B23-Stabilen Komplex in Abwesenheit von RRE-haltigen mRNAs fest. In Gegenwart von RRE mRNA trennt sich Rev von B23 und bindet vorzugsweise an die HIV RRE, was zur Verschiebung von B23²²führt. Es ist nicht bekannt, wo auf subnuklearer Ebene die Tat-Transaktivierung und der Rev-Austauschprozess von B23 gegen HIV mRNA stattfinden. Beide Proteine werden postuliert, um gleichzeitig durch B23-Wechselwirkung in den Zellkern einzudringen. Die Beteiligung anderer zellulärer Wirtsproteine in den HIV-Nukleolar-Weg wird erwartet. Die in dieser Proteomik-Untersuchung beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, das Zusammenspiel des Zellkerns mit den zellulären Wirtsfaktoren bei der HIV-1-Pathogenese aufzuklären.

Die Proteomik-Untersuchung wurde durch die Expression von Rev NoLS-Einpunktmutationen (M4, M5 und M6) und multiplen Argininsubstitutionen (M2 und M9) für die HIV-1-HXB2-Produktion eingeleitet. In diesem Modell wird eine HeLa-Zelllinie, die Rev-defizitieres HIV-1_HXB2 (HLfB) stabil ausdrückt, mit WT Rev- und Rev-Nukleolarmutationen transfiziert, die ein Flag-Tag am Ende der 3 enthalten. Das Vorhandensein von WT Rev ermöglicht eine Virusreplikation in der HLfB-Kultur im Vergleich zu Rev-NoLS-Mutationen, die Rev-Mangel (M2 und M9) nicht retten oder eine Virusreplikation ermöglichen, aber nicht so effizient wie WT Rev (M4, M5 und M6)¹. Das Zelllysat wird 48 h später nach viraler Proliferation in Gegenwart von Rev-Expression gesammelt und einer Immunpräzipitation mit einem Lysepuffer ausgesetzt, der für rev/B23-Interaktion optimiert ist. Lysepufferoptimierung mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen wird beschrieben und Proteinelutionsmethoden für HIV-1 Rev werden in silberbefleckten oder Coomassie-gebeizten SDS-PAGE-Gelen verglichen und analysiert. Der erste Proteomik-Ansatz beinhaltet die direkte Analyse einer eluierten Probe aus exprimierter WT Rev, M2, M6 und M9 durch Tandem-Massenspektrometrie. Ein zweiter Ansatz, bei dem die Eluate von WT Rev, M4, M5 und M6 einem Gelextraktionsprozess unterzogen werden, wird mit dem ersten Ansatz verglichen. Die Peptid-Affinität zu Rev-NoLS-Mutationen im Vergleich zu WT Rev wird analysiert und die Proteinidentifikationswahrscheinlichkeit angezeigt. Diese Ansätze zeigen potenzielle Faktoren (Nukleolar und Nonnukleolar), die an HIV-1 mRNA-Transport und Spleißen mit Rev während der HIV-1-Replikation teilnehmen. Insgesamt sind die beschriebenen Zelllyse-, IP- und Elutionsbedingungen auf virale Proteine von Interesse anwendbar, um die zellulären Wirtsfaktoren zu verstehen, die infektionseuchende Bahnen aktivieren und regulieren. Dies gilt auch für die Untersuchung von zellulären Wirtsfaktoren, die für die Persistenz verschiedener Krankheitsmodelle erforderlich sind. In diesem Proteomik-Modell ist HIV-1 Rev IP für die B23-Interaktion optimiert, um Nukleolar-Faktoren aufzuklären, die an der nukleozytoplasmatischen Stilllegungsaktivität und HIV-1-mRNA-Bindung beteiligt sind. Darüber hinaus können Zelllinien entwickelt werden, die fest mit Infektionskrankheiten ausdrücken, die für wichtige Proteine von Interesse mangelhaft sind, ähnlich der HLfB-Zelllinie, um infektiöse Interessenspfade zu untersuchen.