Quotidiano fototerapia con luce rossa per sviluppo di Biofilm di regolare dei albicans del Candida
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per valutare il risultato dell’applicazione di luce rossa sulla crescita di biofilm di Candida albicans . Un dispositivo di luce rossa non coerente con la lunghezza d’onda di 635 nm e densità di energia di 87,6 J·cm-2 è stato applicato durante la crescita di Candida albicans biofilm per 48 h.
Abstract
Qui, presentiamo un protocollo per valutare gli esiti della diaria di luce rossa trattamento sulla crescita di biofilm di Candida albicans . Per aumentare la crescita planctonica di albicans del c. SN425, gli Inoculanti è cresciuto il lievito azoto Base media. Per la formazione di biofilm, RPMI 1640 media, che hanno alte concentrazioni di aminoacidi, sono state applicate per aiutare la crescita di biofilm. Biofilm di 48 h sono stati curati due volte al giorno per un periodo di 1 min con un dispositivo di luce non coerente (luce rossa; lunghezza d’onda = 635 nm; densità di energia = 87,6 J·cm-2). Come controllo positivo (PC), 0,12% clorexidina (CHX) è stato applicato e come controllo negativo (NC), 0,89% NaCl è stato applicato il biofilm. Unità formanti colonia (UFC), a secco-peso, solubili e insolubili esopolisaccaridi sono stati quantificati dopo i trattamenti. In breve, il protocollo presentato qui è semplice, riproducibile e fornisce risposte per quanto riguarda la redditività, gli importi di polisaccaride extracellulare e di peso a secco dopo trattamento luce rossa.
Introduction
L’aumentata incidenza di diabete, terapia immunosopressiva applicazioni, l’infezione da HIV, epidemia di AIDS, procedure cliniche invasive e consumo di antibiotici ad ampio spettro, negli ultimi anni hanno aumentato l’incidenza di Candida albicans correlate a malattie1,2. Infezioni da c. albicans sono comunemente legati allo sviluppo di biofilm e può causare manifestazioni cliniche, quali la candidosi, o manifestazioni sistemiche, quali candidemia1,2. Uno dei fattori di virulenza più degno di nota della crescita di biofilm è l’istituzione di matrice polisaccaride extracellulare. Formazione di biofilm coopera per aumentare la resistenza ai farmaci antimicotici esistenti, stress ambientale e host meccanismi immuni3.
La crescita di biofilm di c. albicans inizia con l’aderenza iniziale delle cellule planctoniche su un substrato, seguita dalla propagazione di cellule di lievito attraverso la superficie del substrato e la crescita ifale. L’ultima fase di crescita di biofilm è la fase di maturazione, in cui sviluppo lievitiforme è soppresso, lo sviluppo ifale si espande e la matrice extracellulare racchiude il biofilm4. C. albicans esopolisaccaridi (EPS) nella matrice interagiscono per formare i mannano-glucano complesso5,6. L’interazione di esopolisaccaridi è fondamentale per la difesa dei biofilm contro farmaci7. Quindi, la riduzione di EPS da c. albicans extracellulare potrebbe sostenere lo sviluppo di nuovi protocolli di antibiofilm per controllo di candidosi orale.
Luce regola la crescita, sviluppo e comportamento di diversi organismi8 ed è stato applicato come un antimicrobico in chemioterapia fotodinamica antimicrobica (patto). Patto si applica una luce visibile di una specifica lunghezza d’onda e un fotosensibilizzatore luce-assorbente9. Tuttavia, i fotosensibilizzanti hanno difficoltà a penetrare il biofilm, causando più bassa efficacia10. Il fallimento degli agenti terapeutici per infiltrarsi completamente biofilm è un motivo che i biofilm resistono occasionalmente tradizionale terapia antimicrobica3,5. Per disattivare le cellule microbiche recintate, antimicrobici devono permeare attraverso la matrice extracellulare; Tuttavia, l’EPS caratterizza un ostacolo diffusionale per tali molecole spingendo il loro livello di trasporto in biofilm o di influenzare la risposta dell’antimicrobico con matrix stessa11.
Considerando gli svantaggi del patto, l’uso della luce di per sé emerge come un’importante miglioria. Dati preliminari hanno rivelato che il trattamento con luce blu due volte al giorno ha inibito significativamente la produzione di EPS insolubile nel biofilm di Streptococcus mutans . Tramite la diminuzione di insolubile in EPS, luce blu diminuita crescita di biofilm. Tuttavia, i risultati della fototerapia con luce rossa nel biofilm albicans del c. sono scarsi. Quindi, l’obiettivo di questa ricerca era di valutare in quali fototerapia modo utilizzando luce rossa influenza la crescita e la disposizione dei albicans del c. biofilm. Per il trattamento due volte al giorno, abbiamo adattato protocolli precedenti12 9,per fornire un modello semplice e riproducibile biofilm che offre risposte per quanto riguarda la redditività, del nostro laboratorio polisaccaridi extracellulari e di peso a secco importi dopo il trattamento di luce rossa. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per testare altre terapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici per la coltura di successo del biofilm di albicans del c. sono: 1) per fare il pre-inoculo e l’inoculo in mezzo YNB completato con 100 millimetri di glucosio; 2) ad aspettare 90 min per la fase di adesione e lavare accuratamente due volte i pozzetti con 0.89% NaCl per rimuovere le cellule non rispettato; e 3) per aggiungere il terreno RPMI alle cellule aderite per avviare la formazione di biofilm, poiché RPMI stimolerà la crescita di ife. Aneuploidi possono verificarsi quando la coltur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. N. Malvin Janal e Dr. Iriana Zanin per lo sviluppo di questo studio. Riconosciamo anche il Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) per donare il ceppo analizzato in questo studio.
Materials
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
