פוטותרפיה יומי עם אור אדום כדי לווסת קנדידה אלביקנס Biofilm צמיחה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את התוצאה של יישום באור אדום הצמיחה של קנדידה אלביקנס biofilm. מכשיר האור הלא קוהרנטי אדום עם אורך הגל של 635 nm, צפיפות האנרגיה של 87.6 J·cm-2 הוחל ברחבי הצמיחה של קנדידה אלביקנס biofilms במשך 48 שעות.
Abstract
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את התוצאות של אש באור אדום טיפול על צמיחת קנדידה אלביקנס biofilm. כדי להגדיל את צמיחת פלנקטוניים אלביקנס ג SN425, inoculums גדל על בסיס חנקן שמרים מדיה. עבור ביופילמים, מדיה RPMI 1640, אשר יש ריכוזים גבוהים של חומצות אמינו, הוחלו לעזור biofilm צמיחה. Biofilms של 48 שעות טופלו פעמיים ביום למשך תקופה של 1 דקה עם מכשיר האור הלא קוהרנטי (אור אדום; אורך גל = 635 ננומטר; צפיפות אנרגיה = 87.6 J·cm-2). כמו פקד חיובי (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) היה מוחל, וכפי פקד שלילי (NC), 0.89% NaCl היה מוחל על biofilms. המושבה יוצרי יחידות (CFU), exopolysaccharides משקל יבש, מסיסים ובחלקם לא מסיסים היו לכמת לאחר טיפולים. בקצרה, פרוטוקול המובאת כאן היא פשוטה, לשחזור ומספק תשובות לגבי הכדאיות, רב-סוכר משקל יבש, חוץ-תאית כמויות לאחר טיפול באור אדום.
Introduction
שכיחות מוגברת של סוכרת, טיפול לדיכוי המערכת החיסונית יישומים, הידבקות ב- HIV, מגפת האיידס, הליכים פולשניים קליניים צריכת אנטיביוטיקה רחבת-טווח השנים האחרונות הגדילו את השכיחות של קנדידה אלביקנס הקשורים במחלות1,2. זיהומים אלביקנס ג בדרך כלל קשורים להתפתחות biofilm, עלול לגרום הביטויים הקליניים, כגון קנדידה או ביטויים מערכתית, כגון candidemia1,2. אחד הגורמים התקפה אלימה הבולטת ביותר של צמיחה biofilm הוא הממסד מטריצה חוץ-תאית רב-סוכר. ביופילמים משתף פעולה כדי להגדיל את ההתנגדות הקיימת תרופות נגד פטריות, עקה של מנגנונים חיסוניים מארח3.
צמיחת biofilm אלביקנס ג מתחיל עם הדבקות מוקדם של תאים פלנקטוניים מצע, ואחריו התפשטות של תאי שמרים דרך משטח המצע, צמיחה hyphal. השלב האחרון של צמיחה biofilm הוא שלב ההבשלה, שבה, כמו שמרים פיתוח מדוכא מרחיבה את ההתפתחות hyphal, מטריצות יקיף את biofilm4. Exopolysaccharides אלביקנס ג (EPS) המטריצה אינטראקציה כדי ליצור את מנן-גלוקן מורכב5,6. האינטראקציה של exopolysaccharides חיוני להגנה על biofilms נגד סמים7. לפיכך, ההפחתה של EPS של מטריצות אלביקנס ג יכול לתמוך בפיתוח של פרוטוקולים antibiofilm חדשים לבקרת בפה.
אור מווסת צמיחה, התפתחות, התנהגות של אורגניזמים מספר8 , שהוחלה כמו מיקרוביאלית כימותרפיה פוטודינמי מיקרוביאלית (ברית). ההסכם חל על אש גלויה של גל מסוים ו פוטוסנסיטייזר אור קליטת9. אולם, photosensitizers יש קשיים בחדירה של biofilm, גורם היעילות נמוכה10. הכישלון של סוכני טיפולית לחדור biofilms מלא הוא סיבה biofilms להתנגד לעתים טיפול מיקרוביאלית מסורתי3,5. כדי לבטל את תאי חיידקים סגורה, antimicrobials צריך לחדור דרך מטריצה חוץ-תאית; יחד עם זאת, קובצי EPS מאפיינת מכשול diffusional עבור מולקולות כאלה על-ידי המבקשת רמתם של הכרכרה לתוך biofilm או המשפיעים על התגובה של מיקרוביאלית עם המטריצה עצמה11.
בהתחשב החסרונות של ההסכם, מתגלה השימוש באור בפני עצמו שיפור רב ערך. המידע הראשוני חשף כי הטיפול באור כחול פעמיים ביום באופן משמעותי עכבות הייצור של EPS-לא מסיס ב biofilm mutans סטרפטוקוקוס . על ידי הירידה של EPS-לא מסיס, אור כחול פחתה biofilm צמיחה. עם זאת, התוצאות של פוטותרפיה באמצעות אור אדום ב ג אלביקנס biofilms נדירים. לפיכך, מטרת החקירה היה שיש לחשב מה פוטותרפיה באופן באמצעות אור אדום השפעות את הצמיחה ואת סידור biofilm אלביקנס ג . על הטיפול פעמיים ביום, שינינו של המעבדה שלנו הקודם פרוטוקולים9,12 לספק מודל biofilm לשחזור וקלה המספק תשובות לגבי הכדאיות, פוליסכרידים משקל יבש, חוץ-תאית כמויות לאחר טיפול באור אדום. ניתן להשתמש באותו הפרוטוקול לבדיקות טיפולים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר עבור culturing מוצלחת של biofilm אלביקנס ג הם: 1) לעשות את inoculum מראש ולא את inoculum בינוני YNB השלים עם גלוקוז 100 מ מ; 2) כדי לחכות 90 דקות השלב אדהזיה ולשטוף היטב פעמיים הבארות עם 0.89% NaCl כדי להסיר תאים שאינם דבקה; ו 3) כדי להוסיף RPMI בינוני התאים מודבקת להתחיל ביופילמים, מאז RPMI מגרה צ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר פאולה דה Silveira, ד ר Cecília בן מלונות שבדקתי Araújo דה קוסטה, שון מ מאולה, שיין מ מאולה, ד ר מערל (ש ע) Janal, Iriana Zanin ד ר לפיתוח של מחקר זה. אנו גם להכיר את ד ר אלכסנדר ד ג’ונסון (UCSF) עבור תרומת המתח שנותחו במחקר זה.
Materials
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
