JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

Published: May 13, 2019
doi:
10.3791/59324
1Biology Department,Luminex Corporation

Summary

الفحص في المختبر النواة الدقيقة هو وسيلة راسخة لتقييم السمية الجينية والسمية الخلوية ولكن تسجيل الفحص باستخدام الفحص المجهري اليدوي هو شاقة ويعاني من الذاتية وتقلب الهدافين. تصف هذه الورقة البروتوكول الذي تم تطويره لتنفيذ نسخة مؤتمتة بالكامل من الفحص باستخدام قياس تدفق التصوير متعدد الأطياف.

Abstract

غالباً ما يستخدم الفحص في المختبر للنواة الدقيقة (MN) لتقييم السمية الخلوية والسمية الجينية ولكن تسجيل الفحص عن طريق الفحص المجهري اليدوي هو أمر شاق ويدخل عدم اليقين في النتائج بسبب التباين بين الهدافين. ولمعالجة ذلك، تم إدخال الفحص المجهري الآلي لمسح الشرائح وكذلك أساليب قياس التدفق التقليدي في محاولة لإزالة تحيز الهداف وتحسين الإنتاجية. ومع ذلك، هذه الأساليب لها قيودها المتأصلة الخاصة مثل عدم القدرة على تصور السيتوبلازم من الخلية وعدم التحقق من MN البصرية أو تخزين البيانات الصورة مع قياس التدفق الخلوي. وللتصوير المتعدد الأطياف (MIFC) القدرة على التغلب على هذه القيود. تجمع MIFC بين الصور الفلورية عالية الدقة للتنظير المجهري والمتانة الإحصائية وسرعة قياس التدفق التقليدي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تخزين جميع الصور التي تم جمعها في ملفات خاصة بالجرعة. تصف هذه الورقة البروتوكول الذي تم تطويره لتنفيذ إصدار مؤتمت بالكامل من اختبار MN على MIFC. تم توسيع خلايا TK6 اللمفاوية البشرية باستخدام محلول نقص التوتر (75 مل ككل)، ثابتة مع 4٪ فورمالين والمحتوى النووي كان ملطخا Hoechst 33342. تم تشغيل جميع العينات في تعليق على MIFC، مما يسمح بالحصول على صور عالية الدقة لجميع الأحداث الرئيسية المطلوبة للفحص (على سبيل المثال الخلايا binucleated مع وبدون MN وكذلك الخلايا mononucleated وpolynucleated). وقد تم تلقائياً تحديد الصور وتصنيفها وتعدادها في برنامج تحليل البيانات التابع لـ MIFC، مما يسمح بتسجيل السمية الخلوية والسمية الجينية آلياً. وتبين النتائج أن استخدام MIFC لإجراء اختبار MN في المختبر يسمح بالكشف عن زيادات كبيرة إحصائيا في تردد MN في عدة مستويات مختلفة من السمية الخلوية بالمقارنة مع ضوابط المذيبات بعد التعرض لخلايا TK6 إلى ميتوميسين C وكولشيسين، وأنه لا تلاحظ زيادات كبيرة في تردد MN بعد التعرض لمانيتول.

Introduction

وقد تم تطوير البروتوكولات التي تستخدم كل من الفحص المجهري وقياس التدفق والنسخ الضوئي ويتم التحقق منها وتستخدم بشكل روتيني لأداء اختبار MN في المختبر6و7و8و9و10، 11،12،13،14. يستفيد الفحص المجهري من القدرة على التأكيد بصرياً أن MN مشروعة ولكنها تستغرق وقتاً طويلاً وعرضة للتباين بين الهدافين15. لمعالجة هذا، تم تطوير أساليب الفحص المجهري الآلي لمسح الشرائح والتقاط الصور من النوى وMN16،17،18،19،ولكن لا يمكن تصور السيتوبلازم، مما يجعلها من الصعب تحديد ما إذا كانت MN مرتبطة بالفعل بخلية معينة. وعلاوة على ذلك، تواجه هذه الأساليب صعوبات في تحديد الخلايا المتعددة النوى (POLY) (بما في ذلك الخلايا الثلاثية والرباعية) اللازمة لحساب السمية الخلوية عند استخدام Cyt-B9. طرق قياس التدفق الخلوي التي تم تطويرها لأداء التنظير MN توظيف الفلورة، فضلا عن كثافة التشتت إلى الأمام والجانب لتحديد السكان من كل من النوى وMN التي تم تحريرها من الخلية بعد lysis20،21 ،22. وهذا يسمح بالحصول على البيانات من عدة آلاف من الخلايا في بضع دقائق ويسمح بالتحليل الآلي23؛ ومع ذلك، فإن عدم القدرة على تصور الخلايا يجعل من المستحيل التأكد من أن الأحداث المسجلة حقيقية. بالإضافة إلى ذلك، فإن التسين في غشاء الخلية يمنع استخدام Cyt-B وكذلك خلق تعليق يحتوي على حطام آخر مثل المجاميع الكروموسومية أو الأجسام المبرمجة وليس هناك طريقة للتمييز بين هذه من MN24.

وفي ضوء هذه القيود، يعتبر قياس تدفق التصوير المتعدد الأطياف (MIFC) نظاماً مثالياً لإجراء الفحص MN لأنه يجمع بين الصور الفلورية عالية الدقة للتنظير المجهري والمتانة الإحصائية وسرعة قياس التدفق الدقيق التقليدي. في MIFC، يتم إدخال جميع الخلايا في نظام fluidics ومن ثم تركز هيدروديناميا في وسط cuvette خلية تدفق. يتم إنجاز الإضاءة المتعامدة لجميع الخلايا من خلال استخدام الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) من الحقل الساطع، وهو ليزر مبعثر جانبي وليزر فلورسنت واحد (على الأقل). يتم التقاط الفوتونات الفلورية من قبل واحد من ثلاثة (20x أو 40x أو 60x) العدسات الموضوعية ذات الفتحة الرقمية العالية ثم تمر من خلال عنصر التحلل الطيفي. ثم يتم تركيز الفوتونات على كاميرا جهاز المقترنة بالشحن (CCD) للحصول على صور عالية الدقة لجميع الخلايا التي تمر عبر خلية التدفق. لتجنب عدم الوضوح أو الشرائط، تعمل اتفاقية مكافحة التصحر في وضع تكامل تأخير الوقت (TDI) الذي يتتبع الكائنات عن طريق نقل محتوى بكسل من صف إلى صف أسفل اتفاقية مكافحة التصحر في تزامن مع سرعة الخلية في التدفق. ثم يتم جمع معلومات البكسل من الصف الأخير من وحدات البكسل. يسمح التصوير TDI جنبا إلى جنب مع التحلل الطيفي ما يصل إلى 12 صورة (2 BF، 10 الفلورسنت) ليتم التقاطها في وقت واحد من جميع الخلايا التي تمر عبر خلية التدفق. يتم تخزين جميع الصور التي تم التقاطها في ملفات بيانات خاصة بالعين، مما يسمح بإجراء التحليل في أي وقت باستخدام برنامج تحليل البيانات MIFC. وأخيرا، تحتفظ ملفات البيانات بالصلة بين الصور الخلوية والنقاط على جميع المؤامرات ثنائية المتغيرات. وهذا يعني أنه يمكن تسليط الضوء على أي نقطة على مؤامرة ثنائية المتغيرات التقليدية وسيتم عرض الصور BF والفلورسنت المقابلةلها 25.

في الآونة الأخيرة، تم تطوير الأساليب القائمة على MIFC لإجراء اختبار MN لكل من قياس الدوسيد الإشعاعي الفرز26،27،28،29،30،31 والوراثية السموم32،33 اختبار. وقد أثبت هذا العمل أن الصور الخلوية للنوى الرئيسية، MN والسيتوبلازم يمكن تصويرها مع الإنتاجية أعلى من غيرها من الطرق26. يمكن تحديد جميع أنواع الخلايا المطلوبة للتحليل، بما في ذلك خلايا MONO، وBNCs (مع وبلا MN)، وخلايا POLY، تلقائيًا في برنامج تحليل البيانات MIFC، ويتم تنفيذ معايير التهديف التي وضعتها Fenech وآخرون من خلال استخدام خوارزميات رياضية مختلفة6،34. وأظهرت نتائج قياس الجرعات الأحيائية أن منحنيات معايرة استجابة الجرعة كانت مماثلة من حيث الحجم لتلك التي تم الحصول عليها من الأساليب الآلية الأخرى في المؤلفات عند التحديد الكمي لمعدل MN لكل BNC29. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأعمال الأخيرة في علم السموم أن الصور من خلايا MONO، BNCs (مع وبدون MN) وخلايا POLY يمكن التقاطها تلقائيا، وتحديدها، وتصنيفها وتعدادها باستخدام MIFC. ومكّن تحليل البروتوكول والبيانات من حساب السمية الخلوية والسمية الجينية بعد تعريض خلاياTK6 لعدة خلايا من الكلاستوجين اتّباب 32 .

يصف البروتوكول المعروض في هذه الورقة طريقة لإجراء الاختبار MN في المختبر باستخدام MIFC. تتطلب تقنية معالجة العينة المستخدمة في هذا العمل أقل من 2 ساعة لمعالجة عينة واحدة وسهلة الأداء نسبياً بالمقارنة مع أساليب أخرى. تحليل البيانات في برنامج تحليل MIFC معقد، ولكن يمكن إجراء إنشاء قالب التحليل في غضون ساعات قليلة بعد الخطوات المبينة في هذه الورقة. وعلاوة على ذلك، بمجرد إنشاء القالب، يمكن تطبيقه تلقائيا على جميع البيانات التي تم جمعها دون أي عمل آخر. ويحدد البروتوكول جميع الخطوات اللازمة لتعريض خلايا TK6 للكلاستوجينات والأنوجينات، ويصف كيفية زراعة الخلايا ومعالجتها ووصمها، ويوضح كيفية الحصول على صور عالية الدقة باستخدام MIFC. وعلاوة على ذلك، توضح هذه الورقة أفضل الممارسات الحالية لتحليل البيانات في برامج MIFC لتحديد وتسجيل خلايا MONO وBNCs وخلايا POLY تلقائياً لأغراض حساب السمية الخلوية والسمية الجينية.

Protocol

1- إعداد وسائط الثقافة وزراعة خلايا المعارف التقليدية 6 ملاحظة: بعض المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول سامة. استنشاق أو ابتلاع أو الاتصال بالبشرة مع السيتوتشاليسين B يمكن أن تكون قاتلة. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك معطف المختبر واثنين من أزواج من قفازات النتريل. غسل اليدين جيدا بعد التعامل معها. الفورماين / الفورمالديهايد هو سام إذا استنشق أو ابتلع؛ هو مزعج ة للعيون، الجهاز التنفسي، والجلد. وقد يسبب التحسس عن طريق الاستنشاق أو ملامسة الجلد. هناك خطر من ضرر خطير للعيون. وهو مسرطن محتمل. إعداد 565 مل من 1X RPMI الثقافة المتوسطة. إضافة 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X)، 5 مل من بيروفات الصوديوم (100 مل)، 5 مل من البنسلين-ستريبتوميسين-غلوتامين (100x)، و 50 مل من المصل البقري الجنيني (FBS) إلى زجاجة 500 مل من 1x RPMI 1640 المتوسطة. إعداد المتوسطة في خزانة السلامة البيولوجية وتخزينها في 2-8 درجة مئوية. قم بتسخين المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى خلايا TK6 (انظر جدولالمواد). ذوبان 1 مل من خلايا TK6 (المخزنة في -80 درجة مئوية في DMSO) في 10 مل من المتوسطة. طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 8 دقائق واستنشاق supernatant. نقل الخلايا إلى 50 مل من وسائل الإعلام وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. ويختلف الوقت المضاعف لخلايا TK6 من حوالي 12-18 ساعة، وسيلزم عدد قليل (3 أو 4) مقاطع للخلايا للوصول إلى أقصى معدل انتشار لها (انظر جدولالمواد). ثقافة 100 مل من الخلايا إلى تركيز ~ 7-8 × 105 خلايا / مل. 2- إعداد الكلاتوجينات و/أو الأنيوجينات والسيتوتشاليسين باء إعداد تركيزات المخزون المناسبة من الكلاتوجينات وaneugens المطلوب. على سبيل المثال، بالنسبة للميتوميسين C، قم بإذابة زجاجة كاملة 2 ملغ في 10 مل من المياه المعقمة لتحقيق تركيز المخزون النهائي من 200 ميكروغرام /مل. يمكن تخزين ميتوميسين C عند 4 درجة مئوية لمدة ثلاثة أشهر (انظر جدولالمواد). في يوم التجربة، قم بإعداد تخفيف اتّسط من المواد الكيميائية المطلوبة التي تكون أعلى بمقدار 10 أضعاف أو 100 ضعف من تركيزات التعرض المطلوبة إذا تمييعها في الماء المعقمة أو DMSO، على التوالي. بالنسبة لـ Mitomycin C، قم بإعداد 3 مل من تمييع المياه المعقمة من 0.5 و1.0 و2.0 و3.0 و4.0 و5.0 ميكروغرام/مل. لكولشيسين، إعداد 3 مل تخفيف في الماء المعقمة من 0.05، 0.1، 0.2، 0.3، 0.4، و 0.5 ميكروغرام / مل. وأخيرا، لمانيتول، إعداد 3 تخفيف مل في الماء المعقم من 5، 10، 20، 30، 40، و 50 ملغ / مل. إعداد تركيز مخزون 200 ميكروغرام /مل من السيتوتشاليسين B عن طريق حل زجاجة 5 ملغ في 25 مل من DMSO. يمكن تخزين السيتوتشاليسين B عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر. 3- تعرض الخلايا للكلورات و/أو الأنيوجينات إضافة 1 مل من المواد الكيميائية المطلوبة (على سبيل المثال ميتوميسين C) إلى 9 مل من الخلايا في ~ 7-8×105 خلايا / مل في قارورة T25. لعينات التحكم، إضافة 1 مل من الماء المعقم. ضع القوارير في حاضنة CO2 37 درجة مئوية و5% لمدة 3 ساعة.ملاحظة: إذا تم تخفيف المواد الكيميائية في DMSO، أضف فقط 100 ميكرولتر من المادة الكيميائية إلى كل قارورة وأضف 100 ميكرولتر من DMSO إلى الضوابط. يجب أن تحتوي كل قارورة على 9.900 مل من الخلايا. بعد 3 ساعة، إزالة القوارير من الحاضنة ونقل الخلايا إلى أنابيب البولي بروبلين 15 مل. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 8 دقائق، يستنشق supernatant ونقل الخلايا إلى قوارير T25 جديدة تحتوي على ما مجموعه 10 مل من وسط الثقافة الطازجة. إضافة 150 درجة مئوية من تركيز المخزون (200 ميكروغرام/مل) من السيتوتشاليسين B إلى كل قارورة لتحقيق تركيز نهائي قدره 3 ميكروغرام/مل. إعادة القوارير إلى حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لفترة الانتعاش يساوي 1.5-2.0 مضاعفة مرات، على النحو الموصى به في المبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي9. بالنسبة لخلايا TK6 المستخدمة في هذا العمل، كان وقت الاسترداد 24 ساعة.ملاحظة: كان الوقت المضاعف لخلايا TK6 المستخدمة هنا 15 ساعة وتم استخدام وقت استرداد قدره 24 ساعة (1.6 مرات مضاعفة). وسيؤدي الانتعاش مرات أقل من 1.5 مرات مضاعفة إلى الحد من الانتشار في العينات المعرضة لجرعات أعلى تؤثر على عدد من الناقلات الوطنية. انحراف حسابات السمية الخلوية. 4- إعداد المخازن المؤقتة لتثبيت محتوى الحمض النووي ووسمه (انظر جدول المواد) إعداد 75 مل من كلوريد البوتاسيوم (KCl) عن طريق إضافة 2.79 غرام إلى 500 مل من المياه النقية جدا. حرّك الحل لمدّة 5 دقائق باستخدام النمام المغناطيسي وفلتر معقم من خلال فلتر بقوة 200 متر. يمكن تخزين محلول KCl 75 mM عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر. إعداد كمية كافية من 4٪ رسمي للتجربة، وتوقع أن ما مجموعه 2.1 مل يجب أن تضاف إلى كل عينة. على سبيل المثال، لإعداد 10 مل من 4٪ فورمالين، إضافة 4 مل من 10٪ رصيد رسمي إلى 6 مل من 1X دولبيكو الفوسفات المخزنة محلول ملحي دون كاليفورنيا2 + أو ملغ2 + (PBS). يمكن تخزين هذا 4٪ فورمالين في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع. إعداد 510 مل من العازلة غسل (2٪ FBS في 1X PBS) عن طريق إضافة 10 مل من FBS إلى زجاجة 500 مل من PBS 1X. إعداد 10 مل من تركيز 100 ميكروغرام/مل من Hoechst 33342 بإضافة 100 ميكرولتر من تركيز المخزون (1 ملغم/مل) إلى 9900 ميكرولتر من 1X PBS. يمكن تخزين حل Hoechst 33342 عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لعدة أشهر. 5. معالجة العينة: تورم نقص التوتر، والتثبيت، عد الخلايا ووضع العلامات محتوى الحمض النووي في نهاية فترة الانتعاش، وإزالة جميع القوارير من الحاضنة ونقل جميع العينات إلى أنابيب البولي بروبلين 15 مل. الطرد المركزي جميع العينات في 200 × ز لمدة 8 دقائق. يستنشق supernatant، وإعادة تعليق الخلايا وإضافة 5 مل من 75 مل ككل. إضافة 2 مل من 4٪ شكلي في كل عينة، ومزيج بلطف عن طريق الانعكاس ثلاث مرات وحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تعمل هذه الخطوة بمثابة “تثبيت لينة”. الطرد المركزي جميع العينات في 200 × ز لمدة 8 دقائق. هذه الخطوة بمثابة “تثبيت الثابت”. إضافة 5 مل من العازلة غسل والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 8 دقائق. نقل جميع العينات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. إجراء عدد خلايا على كل عينة لتحديد عدد الخلايا لكل عينة. وسوف تكون العينات مركزة للغاية بحيث يتم الحاجة إلى تخفيف 1:100 في 1X PBS (10 ميكرولتر من العينة في 990 ميكرولتر من PBS) للحصول على عدد دقيق.ملاحظة: في هذه المرحلة من الأفضل إجراء عمليات عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومات. إضافة KCl يعطي السيتوبلازم مظهر شفاف، مما يجعل من الصعب على عدادات الخلية الآلي التعرف عليها. أيضا، العدادات الآلية لديها صعوبة في تسجيل الخلايا متعددة النوى بسبب حجمها. إذا لم يتم تشغيل العينات على MIFC على الفور، يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لعدة أيام. عندما تكون جاهزة لتشغيل العينات، إضافة 5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل لكل 1×106 خلايا / مل لكل عينة. كما يضاف 10 ميكرولتر من 500 ميكروغرام/مل من RNase لكل 100 ميكرولتر من العينة لتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام/مل. حضانة العينات في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي الدقيقة جميع العينات في 200 × ز لمدة 8 دقائق واستخدام ماصة لإزالة supernatant ترك ~ 30 درجة مئوية. استخدام ماصة لإعادة تعليق جميع العينات قبل تشغيل على MIFC ضمان عدم وجود فقاعات في الأنبوب. لا دوامة. 6. بدء ومعايرة MIFC تأكد من غمد، نظام معايرة الكاشف، debubbler، المطهر والتعقيم حاويات ممتلئة وخزان النفايات فارغة. قم بتشغيل النظام وانقر نقرًا مزدوجًا على رمز برنامج MIFC. انقر فوق الزر بدء التشغيل وتأكد من تحديد خانة الاختيار بدء كافة المعايرة والاختبارات. وهذا سوف مسح النظام، غمد الحمل والكواشف معايرة النظام، ومعايرة النظام (انظر جدولالمواد). 7. تشغيل عينات على MIFC ملاحظة: يفترض هذا المقطع استخدام MIFC كاميرا 2. إذا كنت تستخدم كاميرا MIFC 1، يرجى الاطلاع على الملحق 1 – البروتوكول الكامل، القسم 7 لإنشاء قطع الأراضي أثناء الاقتناء إطلاق برنامج الحصول على بيانات MIFC (انظر جدول المواد). ويبين الشكل 1 إعدادات الأداة. تشغيل الليزر 405 نانومتر وتعيين قوة الليزر إلى10 mW (A). تعطيل جميع أشعة الليزر الأخرى (بما في ذلك SSC) وتعيين BF إلى القنوات 1 و 9 (B). تأكد من تعيين شريط تمرير التكبير إلى60x (C)، يتم تحديد وضع الحساسية العالية (D)، وأن القنوات 1 و7 و9 فقط تظهر في معرض الصور. انقر على رمز مبعثر. حدد كافة التجمعات وحدد المنطقة M01 على المحور س ونسبة العرض إلى الارتفاع M01 على المحور ص. انقر على رمز منطقة مربع ورسم منطقة حول الخلايا المفردة. اسم هذه المنطقة خلايا واحدة. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وحدد المناطق. قم بتمييز منطقة الخلايا المفردة وتغيير إحداثيات x إلى 100 و900 وتغيير إحداثيات y إلى 0.75 و 1 (الشكل1I). انقر على رمز مبعثر. حدد خلايا مفردة كمجموعة الأصل، وحدد تدرج RMS M01 على المحور س، وتدرج RMS M07 على المحور ص. انقر على رمز منطقة مربع ورسم منطقة حول غالبية الخلايا. اسم هذه المنطقة الخلايا المركزة. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وحدد المناطق. تسليط الضوء على منطقة الخلايا المركزة وتغيير إحداثيات س إلى 55 و 75 وتغيير إحداثيات y إلى 9.5 و 20 (الشكل1J). انقر على أيقونة الرسم البياني. حدد مجموعة خلايا المركزة وحدد كثافة M07 كميزة. انقر على أيقونة المنطقة الخطية ورسم منطقة عبر الذروة الرئيسية في الرسم البياني. اسم هذه المنطقة الحمض النووي إيجابية. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وحدد المناطق. تسليط الضوء على المنطقة الإيجابية للحمض النووي وتغيير الإحداثيات إلى 2 × 105 و 2 × 106. قد يكون من الضروري تعديل النطاق اعتمادا على ذروة الكثافة على الرسم البياني (الشكل1K). تعيين معلمات الاكتساب (الشكل1E). حدد اسم الملف والمجلد الوجهة، وقم بتغيير عدد الأحداث إلى 20,000، وحدد عدد التجمعات الإيجابية للحمض النووي. انقر فوق تحميل (الشكل1F)ووضع عينة التحكم في MIFC. انقر فوق الزر اكتساب لجمع البيانات (الشكل1G). بمجرد اكتمال عملية الشراء، انقر فوق الزر إرجاع لإرجاع العينة (الشكل1H). إزالة أنبوب عينة من الصك. كرر هذه العملية لكافة العينات المتبقية في التجربة. 8. فتح ملف بيانات في IDEAS إطلاق حزمة برامج تحليل MIFC (انظر جدولالمواد). انقر على بدء التحليل لبدء تشغيل “فتح ملفمعالج”. حدد ملف بيانات عن طريق الاستعراض إلى ملف الصورة الخام المطلوب (.rif). انقر فوق الزر فتح ثم انقر فوق التالي. بما أن هذا هو تحليل لون واحد، التعويض ليس ضرورياً لذلك انقر فوق التالي لتجاوز خطوة التعويض. في هذه المرحلة لا يوجد قالب تحليل لتطبيق، لذلك انقر فوق التالي مرة أخرى. إذا تم تنزيل قالب التحليل من المواد التكميلية، فحدده الآن. تعمل هذه القوالب فقط مع كاميرا MIFC 2 مع BF تعيين إلى القنوات 1 و 9 والصور النووية في القناة 7 أثناء الاستحواذ. بشكل افتراضي، يتم إنشاء أسماء الملفات .cif و .daf تلقائياً لمطابقة .rif. لا ينصح بتغيير أسماء .cif و .daf. انقر فوق التالي. تعيين خصائص عرض الصورة عن طريق تحديد 01 و 07. انقر فوق التالي. لا يوجد معالج لهذا التطبيق، لذا انقر فوق إنهاء. من المهم جداً حفظ ملف تحليل البيانات (.daf) ونموذج التحليل (.ast) في كثير من الأحيان أثناء الأقسام 9-14 لتجنب فقدان التقدم. 9. إنشاء أقنعة وميزات لتحديد BNCs انقر على أيقونة خصائص معرض الصور (رمز أزرق/أبيض). في علامة التبويب خصائص العرض انقر فوق تعيين النطاق إلى بيانات البكسل ثم تغيير اللون إلى الأصفر. انقر فوق موافق. صور Hoechst الآن أسهل لعرضها على خلفية سوداء. إنشاء مؤامرة الخلايا غير المبرمجة. انقر على علامة التبويب تحليل، ثم انقر على أقنعة. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. ضمن وظيفة اختيار عتبة،تحت قناع اختيار M07 وتعيين نسبة الكثافة إلى 50. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. انقر فوق إغلاق. انقر على علامة التبويب تحليل، وانقر على الميزات، ثم انقر فوق جديد. بالنسبة لنوع الميزة حدد المنطقة. لقناع حدد عتبة (M07، Ch07،50). انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق. انقر فوق إغلاق لبدء حساب قيم المعالم. انقر على أيقونة نقطة مؤامرة. حدد كافة السكان. لميزة المحور س اختر ميزة Contrast_M01_Ch01 وميزة المحور ص اختر Area_Threshold(M07,Ch07,50). انقر فوق موافق. انقر فوق الزر منطقة مربع ورسم منطقة حول غالبية الخلايا. استدعاء هذه المنطقة غير apoptotic. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وانقر فوق المناطق. تسليط الضوء على المنطقة غير المبرمجة. تعيين إحداثيات س إلى 0 و 15 وتعيين إحداثيات y إلى 50 و 300. انقر فوق إغلاق. إنشاء قناع BNC (الخطوات 9.3.1 إلى 9.3.5) لتعريف الخلايا التي تحتوي على نواة اثنين فقط. تصفح لBNC في معرض الصور وانقر عليه. هذا هو لتصور خلق القناع في قناة Hoechst. انقر على علامة التبويب تحليل، ثم انقر على أقنعة. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. ضمن وظيفة اختيار LevelSet، تحت قناع اختيار M07، حدد زر الاختيار قناع المستوى الأوسط ، وتعيين مقياس التفاصيل كفاف إلى 3.00. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة، واختيار تمدد،وتحت قناع اختيار LevelSet (M07، Ch07، الأوسط، 3). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07، وقم بتعيين عدد البيكسلات إلى 2. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة اختيار مستجمعاتالمياه، وتحت قناع اختيار تمدد (LevelSet(M07، Ch07، الأوسط، 3) 2). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07، وقم بتعيين سمك الخط إلى 1. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة اختيار المدى،تحت قناع اختيار مستجمعات المياه (Dilate(LevelSet(M07، Ch07، الأوسط، 3)2)). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07. تعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى للمساحة إلى 115 و 5000 على التوالي. تعيين قيم نسبة العرض إلى الارتفاع الحد الأدنى والحد الأقصى إلى 0.4 و 1 على التوالي. انقر فوق موافق. في الحقل الاسم تغيير النص لقراءة BNC ثم انقر فوق موافق. إنشاء الميزات والمؤامرات للحصول على السكان BNC النهائي بقعة عدد BNC ميزة: انقر على علامة التبويب تحليل، ثم الميزات،ثم جديد. لنوع الميزة حدد عدد النقاط. بالنسبة للقناع، حدد قناع BNC النهائي الذي تم إنشاؤه في 9.3.5. تعيين الاتصال إلى أربعة وتغيير الاسم إلى عدد النقاط BNC. انقر فوق موافق ثم إغلاق لحساب قيم المعالم. الرسم البياني لـ BNC. انقر فوق رمز الرسم البياني. حدد غير أبوبتوتيك كمجموعة الأصل. بالنسبة لميزة المحور س اختر ميزة BNC عدد النقاط. انقر فوق موافق. انقر على أيقونة المنطقة الخطية. رسم منطقة عبر بن 2. استدعاء هذه المنطقة 2N.ملاحظة: الرجوع إلى القسم 9 في الملحق 1 – البروتوكول الكامل لإنشاء الأقنعة والميزات والمؤامرات المتبقية لتحديد السكان BNC النهائي 10. خلق أقنعة وميزات لتحديد MN ضمن السكان BNC إنشاء قناع MN. استعرض للحصول على BNC الذي يحتوي على MN في معرض الصور وانقر عليه. هذا هو لتصور إنشاء قناع MN في قناة Hoechst. انقر على علامة التبويب تحليل، ثم انقر على أقنعة. إنشاء قناع تعريف موضعي 1: انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. ضمن وظيفة اختيار بقعة وضمان تحديد زر الاختيار مشرق. تحت قناع اختيار M07، تعيين بقعة إلى خلية نسبة الخلفية إلى 2.00. تعيين نصف القطر الحد الأدنى إلى 2 وأقصى نصف قطر إلى 6. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة اختيار المدى،وتحت قناع اختيار LevelSet (M07، Ch07، الأوسط، 3). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07. تعيين الحد الأدنى والحد الأقصى للمنطقة إلى 80 و 5000 على التوالي. تعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لنسبة العرض إلى العرض إلى 0 و 1 على التوالي. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. انقر فوق جديد ثم انقر فوق دالة. تحت وظيفة اختيار تمدد، تحت قناع اختيار المدى (LevelSet (M07، Ch07، الأوسط، 3)، 80-5000،0-1). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07. تعيين عدد وحدات البكسل إلى 2. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. انقر فوق جديد. انقر نقرا مزدوجا على بقعة (M07، Ch07، مشرق، 2، 6، 2) قناع لإضافته إلى تعريف القناع. انقر فوق عامل التشغيل And ثم عامل التشغيل Not. انقر نقراً مزدوجاً فوق قناع التمدد (النطاق (LevelSet(M07، Ch07، الأوسط، 3)، 80-5000، 0-1)، 2) لإضافته إلى تعريف القناع. انقر فوق موافق. انقر فوق جديد، ثم دالة. ضمن وظيفة اختيار نطاق وتحت قناع اختيار القناع الذي تم إنشاؤه في 10.1.1.4: حدد بقعة (M07، Ch07، مشرق، 2، 6، 2) وليس ديلاتي (المدى (LevelSet (M07، Ch07، الأوسط، 3)، 80-5000، 0-1)، 2). تعيين الصورة إلى عرض إلى Ch07. تعيين الحد الأدنى والحد الأقصى للمنطقة إلى 10 و 80 على التوالي. تعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لنسبة العرض إلى الارتفاع إلى 0.4 و1 على التوالي. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. اكتمال قناع تحديد الهوية الموضعية 1.ملاحظة: الرجوع إلى القسم 10 في الملحق 1 – البروتوكول الكامل لإنشاء الأقنعة والميزات والمؤامرات لتحديد السكان MN النهائي 11. إنشاء أقنعة وملامح والمؤامرات لتحديد السكان Mononucleateated وPolynucleated إنشاء قناع POLY. انقر فوق تحليل، ثم أقنعة، ثم وظيفة جديدة . تحت وظيفة اختيار المدى،تحت قناع اختيار مستجمعات المياه (LevelSet (LevelSet(M07، Ch07، الأوسط، 3)، 2)). قم بتعيين الصورة لعرضها إلى Ch07. تعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى للمنطقة إلى 135 و 5000 على التوالي. تعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى لنسبة العرض إلى 0.4 و 1 على التوالي. انقر فوق موافق. في الحقل الاسم، قم بتغيير النص لقراءة POLY ثم انقر فوق موافق ثم أغلق. تم إكمال قناع الخلية متعدد النوى. إنشاء أقنعة مكون POLY. بولي مكون قناع 1: انقر على علامة التبويب تحليل، ثم أقنعة،ثم جديد،ثم وظيفة. ضمن وظيفة حدد مكون، وتحت قناع حدد قناع POLY. لترتيب ميزة حدد المنطقة، ولفرز النظام انقر فوق زر الاختيار تنازلي. تعيين رتبة إلى 1. انقر فوق موافق ثم موافق مرة أخرى. أقنعة مكون بولي 2 و 3 و 4: كرر كافة الخطوات في 11.2.1 باستثناء تعيين رتبة إلى 2و 3 و 4 لإنشاء أقنعة المكون الفردية. عدد النقاط باستخدام قناع POLY. انقر فوق علامة التبويب تحليل، ثم الميزات، ثم جديد. بالنسبة لنوعالميزة، حدد عدد النقاط. للقناع اختر قناع بولي وتعيين الاتصال في 4. انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق ثم إغلاق لحساب قيم المعالم. انقر فوق رمز الرسم البياني. حدد السكان غير المبرمجين. بالنسبة لميزة المحور س اختر ميزة Count_POLY_4 الموضعية. منطقة عدد النقاط أحادية. انقر على أيقونة المنطقة الخطية. رسم منطقة عبر بن 1 على الرسم البياني الذي تم إنشاؤه في 11.3.2. استدعاء هذه المنطقة 1N. منطقة عد البقعة TRI. انقر على أيقونة المنطقة الخطية. رسم منطقة عبر بن 3 على الرسم البياني الذي تم إنشاؤه في 11.3.2. استدعاء هذه المنطقة 3N. منطقة العد الموضعي ة أحادية رباعية. انقر على أيقونة المنطقة الخطية. رسم منطقة عبر بن 4 على الرسم البياني الذي تم إنشاؤه في 11.3.2. استدعاء هذه المنطقة 4N. تحديد السكان MONO. إنشاء ميزة نسبة العرض إلى الارتفاع MONO. انقر فوق علامة التبويب تحليل، ثم الميزات، ثم جديد. ضمن نوع الميزة، حدد ميزة نسبة العرض إلى الارتفاع وضمن قناع حدد مكون (1، منطقة، بولي، تنازلي). انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق. إنشاء ميزة التعميم MONO. مع استمرار فتح إطار “إدارة الميزات”، انقر فوق جديد. ضمن نوع الميزة، حدد ميزة التعميم وضمن قناع حدد مكون (1، منطقة، بولي، تنازلي). انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق ثم انقر فوق إغلاق لحساب قيم المعالم. للحصول على مخطط نقطة الخلايا MONO الدائرية، انقر فوق رمز رسم نقطة. حدد 1N كمجموعة الأصل. لميزة محور س اختر Circularity_Component(1، منطقة، بولي، تنازلي) وميزة محور ص اختر نسبة العرض إلى الارتفاع_المكون (1، منطقة، بولي، تنازلي). انقر فوق موافق. انقر على زر منطقة مربع ورسم منطقة حول السكان الخلية نحو الجزء الأيمن العلوي من المؤامرة. اسم هذه المنطقة Circular_1N. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وانقر فوق المناطق. تمييز منطقة Circular_1N. تغيير إحداثيات X إلى 20 و 55 وتغيير إحداثيات Y إلى 0.85 و 1.0. انقر فوق إغلاق. إنشاء ميزة بولي/Area_M07 المنطقة. انقر فوق علامة التبويب تحليل، ثم الميزات، ثم جديد. ضمن نوع الميزة، حدد ميزة المنطقة وضمن قناع حدد مكون (1، منطقة، بولي، تنازلي). انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق. مع إطار “إدارة الميزات” لا يزال مفتوحاً، انقر فوق جديد ثم ضمن نوع الميزة انقر فوق زر الاختيار المدمجة. من قائمة الميزات، قم بتمييز Area_Component(1، المنطقة، بولي، تنازلي) وانقر فوق السهم لأسفل لإضافته إلى تعريف الميزة. انقر فوق رمز القسمة (/). حدد ميزة Area_M07 وانقر فوق السهم لأسفل لإضافته إلى تعريف الميزة. انقر فوق تعيين الاسم الافتراضي ثم انقر فوق موافق. انقر فوق إغلاق لبدء حساب قيم المعالم. للحصول على مخطط نقطة السكان MONO النهائي، انقر فوق رمز مؤامرة نقطة. حدد Circular_1N كمجموعة الأصل. لميزة محور س اختيار نسبة العرض إلى الارتفاع_M07 وميزة محور ص اختيار Area_Component(1، منطقة، بولي، تنازلي) / Area_M07. انقر فوق موافق. انقر فوق الزر منطقة مربع ورسم منطقة حول غالبية الخلايا. اسم هذه المنطقة Mononucleated. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة وانقر فوق المناطق. تسليط الضوء على منطقة Mononucleated. تغيير إحداثيات X إلى 0.85 و 1.0 وتغيير إحداثيات Y إلى 0.55 و 1.0. انقر فوق إغلاق.ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المادة 11 من الملحق 1 – البروتوكول الكامل لإنشاء الأقنعة والسمات والمؤامرات لتحديد السكان الترينوكليون ومتعددي النوى النهائيين. 12. إنشاء طريقة عرض مخصصة لفحص أقنعة BNC وMN انقر على زر خصائص معرض الصور ثم انقر فوق علامة التبويب عرض. انقر على علامة التبويب مركبات ثم انقر فوق جديد. تحت اسم نوع Ch01/Ch07. انقر فوق إضافة صورة. ضمن صورة اختر Ch01 وتعيين النسبة المئوية إلى 100. انقر فوق إضافة صورة مرة أخرى، ضمن اختيار الصورة Ch07 وتعيين النسبة المئوية إلى 100. انقر فوق جديد و ضمن نوع الاسم أقنعة BNC و MN انقر فوق إضافة عمود. ضمن نوع الصورة اختر Ch01 وتحت قناع اختيار لا شيء انقر فوق إضافة عمود. ضمن نوع الصورة اختر Ch07 وتحت قناع اختيار لا شيء انقر فوق إضافة عمود. تحت نوع الصورة اختيار Ch07 وتحت قناع اختيار BNC انقر فوق إضافة عمود. ضمن نوع الصورة اختر Ch07 وتحت قناع اختيار قناع MN انقر فوق إضافة عمود. ضمن نوع الصورة انقر فوق زر الاختيار المركب. يجب إضافة الصورة المركبة Ch01/Ch07 تلقائياً إلى طريقة العرض. انقر فوق موافق لإغلاق الإطار خصائص معرض الصور. 13. إنشاء طريقة عرض مخصصة لفحص قناع بولي راجع القسم 13 في الملحق 1 – البروتوكول الكامل لإنشاء طريقة عرض مخصصة لفحص قناع POLY 14 – إنشاء جدول إحصاءات لتعداد الأحداث الرئيسية انقر على علامة التبويب تقارير ثم انقر فوق تعريف تقرير الإحصائيات. في الإطار الجديد، انقر فوق إضافة أعمدة. إضافة إحصائيات عدد BNC. تحت إحصائيات حدّد عدد وتحت ينتقى السّكان ينتقي ال [بنكس] السّكان. انقر فوق إضافة إحصائيات لإضافة الإحصاء إلى القائمة. كرر الخطوة 14.2 لإنشاء أعمدة منفصلة لتجمعات BNCs و MONOو TRI و POLY. انقر فوق إغلاق ثم انقر فوق موافق. قالب تحليل البيانات مكتمل(الشكل 2). حفظ القالب (ملف، حفظ كقالب). يمكن العثور على قائمة قناع كامل في الملحق 2 – قائمة القناع. 15. ملفات تجربة عملية الدفعباستخدام قالب تحليل البيانات ضمن القائمة أدوات انقر فوق ملفات البيانات الدفعية ثم انقر فوق إضافة دفعة في الإطار الجديد. في الإطار الجديد انقر فوق إضافة ملفات لتحديد ملفات التجربة (.rif) لإضافتها إلى المجموعة. ضمن الخيار تحديد قالب أو ملف تحليل بيانات (.ast، .daf) ، انقر فوق رمز المجلد المفتوح للاستعراض إلى وفتح قالب تحليل البيانات (ملف .ast) الذي تم حفظه في الخطوة 14.4. انقر فوق الزر معاينة تقرير إحصائيات لمعاينة جدول الإحصائيات. لن يتم عرض أية قيم هنا حيث لم يتم حسابها بعد. ومع ذلك، تعمل هذه الخطوة كتدقيق للتأكد من تحديد قالب التحليل الصحيح قبل تشغيل المجموعة. انقر فوق موافق لإغلاق الإطار الحالي. ثم انقر فوق إرسال دفعات لبدء معالجة المجموعة من كافة الملفات. عند اكتمال معالجة المجموعة، سيكون ملف .txt متوفراً في المجلد الذي يحتوي على كافة ملفات .rif. استخدم هذه الإحصائيات لحساب السمية الجينية والسمية الخلوية. 16- حساب بارامترات السمية الجينية والسمية الخلوية حساب السمية الجينية: لحساب السمية الجينية، استخدم جدول الإحصاءات الذي تم إنشاؤه في 15.5. قسمة عدد الخلايا في عدد الخلايا BNCs MN على عدد الخلايا في السكان BNCs ثم ضرب 100: حساب السمية الخلوية: تحديد العدد الإجمالي لخلايا POLY عن طريق جمع عدد الخلايا TRI وQUAD. حساب مؤشر انتشار كتلة السيتوكينيسيس (CBPI) باستخدام عدد الخلايا في MONO و BNCs و POLY كما يلي: وأخيراً، حساب السمية الخلوية لكل ثقافة باستخدام قيم CBPI من ثقافات التحكم (C) والثقافة المكشوفة كيميائياً (T) على النحو التالي:

Representative Results

وتتيح طريقة التحليل المبينة في هذه الورقة تحديد وتسجيل الشركات الوطنية للبيانات تلقائياً، مع السمية الجينية أو بدونها، لحساب السمية الجينية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم أيضا تحديد خلايا MONO وPOLY تلقائيا وسجل لحساب السمية الخلوية. يتم تنفيذ معايير تسجيل النقاط المنشورة6و34 التي يجب الالتزام بها عند تسجيل هذه الأحداث في برنامج تحليل البيانات MIFC. وتشير النتائج المعروضة هنا إلى أنه يمكن الكشف عن زيادات كبيرة إحصائياً في تواتر السمية الشمالية مع زيادة السمية الخلوية بعد تعرض خلايا TK6 اللمفاوية البشرية للمواد الكيميائية المعروفة التي تحفز MN (ميتوميسين C وكولشيسين). وقد ثبت نتائج مماثلة للمواد الكيميائية الإضافية التي تم اختبارها في منشور منفصل32. وبالإضافة إلى ذلك، تبين النتائج الناجمة عن استخدام مانيتول أنه يمكن أيضاً تحديد المواد الكيميائية غير المحفزة للMN بشكل صحيح باستخدام طريقة MIFC المبينة هنا. المعلمات الموضحة في البروتوكول لإنشاء كافة الأقنعة والميزات وحدود المنطقة من المرجح أن يكون لديك تعديل إذا تم استخدام أنواع الخلايا المختلفة (مثل خلايا الهامستر الصينية) لإجراء التقييم. ويبين الشكل 3 أربعة أفرقة مختارة لتحديد المراكز الوطنية للإنشاء والقدرات (الشكل3ألف-3D). يظهر هنا رسم بياني يتيح اختيار الخلايا ذات النوى اثنين (الشكل3A)والمؤامرات ثنائية المتغيرات التي تمكن من اختيار BNCs مع التعميم مماثلة (الشكل3B)، والمناطق المماثلة والكثافات (الشكل3C ) وBNCs التي لديها جيدة منفصلة، والنوى غير متداخلة (الشكل3D) وفقا لcritieria التهديف6،34. الشكل 3 E يظهر BF وHoechst الصور وكذلك أقنعة BNC وMN تشير إلى أنه يمكن تحديد BNCs مع MN واحدة أو متعددة وتعدادها. وهذا يسمح بحساب السمية الجينية عن طريق تحديد معدل الـ BNCs الميكرونوي في عدد السكان النهائي من BNC. يظهر الشكل 4 تطبيق ميزة “عدد موضعي” باستخدام قناع POLY لتعريف الخلايا أحادية وثلاثية ورباعية. ويمكن بعد ذلك جمع عدد الخلايا الثلاثية ورباعية للحصولعلى العدد النهائي من خلايا POLY (الجدول 1). وهذا يمكّن من حساب السمية الخلوية باستخدام الصيغة الموضحة في البروتوكول. ولذلك، يمكن تقييم كل نقطة جرعة في التجربة من خلال كل من السمية الجينية ومعلمات السمية الخلوية. ويبين الشكل 5 السمية الجينية وقيم السمية الخلوية للأنوجين كولشيسين، وميتوميسين C كلستوجين وللسيطرة السلبية، مانيتول. بالنسبة للكولشيسين (الشكل5ألف)فإن جرعات 0.02 إلى 0.05 ميكروغرام/مل تنتج زيادات كبيرة إحصائياً في تردد MN، تتراوح بين 1.28% إلى 2.44% على التوالي على التحكم في المذيبات (الجدول1). وفي حالة ميتوميسين جيم(الشكل 5باء)أنتجت الجرعتان العلويتان 0.4 و0.5 ميكروغرام/مل ترددات MN هامة إحصائياً بالمقارنة مع ضوابط المذيبات. وكانت ترددات الـ MN هذه 0.93 في المائة عند 0.4 ميكروغرام/مل و1.02في المائة عند 0.5 ميكروغرام/مل (الجدول 2). وأخيراً، بالنسبة لمانيتول (الشكل5جيم)،لا توجد جرعات تم اختبارها تؤدي إلى سمية مسيوية تزيد على 30 في المائة، كما أنها لم تنتج زيادات كبيرة في تواتر السمية المتعددة الجنسيات مقارنة بضوابط المذيبات، كما هو متوقع (الجدول3). الشكل 1 إعدادات أداة MIFC. لقطة شاشة من إعدادات MIFC كما هو موضح في القسم الخطوة 7 من البروتوكول. (أ) وضع قوة الليزر 405 نانومتر إلى 10 مواطوات. (ب) وضع قنوات BF 1 و 9. (C) اختيار عدسة التكبير 60x الهدف. (D) تحديد أبطأ سرعة تدفق الذي يولد الصور مع أعلى دقة. (هـ)تحديد عدد الأحداث التي سيتم جمعها إلى 20,000. (F) النقر فوق الزر تحميل لبدء عملية تحميل العينة. (G) النقر فوق الزر اكتساب لبدء الحصول على الصور. (H) النقر فوق الزر إرجاع لإرجاع أي عينة غير مستخدمة. (I) scatterplot من نسبة العرض إلى الارتفاع BF مقابل منطقة BF لاختيار الخلايا المفردة. (ي) مبعثر من Hoechst التدرج RMS مقابل BF التدرج RMS لاختيار الخلايا المركزة. (K) الرسم البياني من كثافة Hoechst لاختيار الخلايا الإيجابية الحمض النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2 تحليل استراتيجية التجمع البرمجيات. لقطة شاشة لاستراتيجية التغرير الموصوفة في القسم 9 من البروتوكول. وتظهر المناطق بترتيب تسلسلي لتحديد الخلايا البينوكلية (المربع الأحمر)، وmicronuclei (المربع الأصفر)، والخلايا الأحادية والمتعددة النوى (المربع الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3 تحديد وتسجيل الشركات الوطنية مع أو بدون MN. (أ) اختيار الخلايا التي تحتوي على اثنين من النوى متميزة. (ب) تحديد الخلايا البينوكلية (BNCs) التي تحتوي على اثنين من النوى الدائرية للغاية من خلال استخدام ميزة كثافة نسبة العرض إلى الارتفاع. (ج) اختيار BNCs التي لديها نوى مع مناطق مماثلة وكثافة. ويتم ذلك عن طريق حساب نسبة مساحة كل من النوى ونسبة نسبة العرض إلى الارتفاع لكل من النوى. (D) استخدام ميزات نسبة الشكل ونسبة العرض إلى الارتفاع لتحديد BNCs التي تحتوي على اثنين من النوى المنفصلة بشكل جيد. (E) ميزة “عدد النقاط” باستخدام قناع النواة الدقيقة (MN) مما يدل على أنه يمكن تعريف BNCs مع MN واحد أو متعدد وتعدادها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4 تحديد وتسجيل خلايا مونو وبولي. استخدام ميزة العد الموضعي لتحديد وتعداد الخلايا الأحادية والثلاثية وquadranucleated. قناع المكون 1 يسمح بتحديد الخلايا mononucleated (الصورة العليا). أقنعة المكون 1 إلى 3 يسمح بتحديد الخلايا trinucleated (الصورة الوسطى). أقنعة المكون 1 إلى 4 يسمح بتحديد الخلايا quadranucleated (الصورة السفلية). تم تعديل هذا الرقم من رودريغز 201832. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5 التحديد الكمي للسمية الخلوية. السمية السيتومية كميا باستخدام مؤشر انتشار كتلة السيتوكينيسيس (الدوائر السوداء) والسمية الجينية كميا باستخدام النسبة المئوية من MN (قضبان واضحة) بعد التعرض 3 ح و 24 ح الانتعاش ل (أ) كولشيسين ، (ب) ميتوميسين C و ( ج)مانيتول. وتشير النجوم إلى زيادات كبيرة إحصائياً في تواتر النطاقات المتعددة الجنسيات مقارنة بالضوابط (اختبار تشي تربيع؛ *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). جميع الكميات هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة. تم تعديل هذا الرقم من رودريغز 201832. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول 1: المعلمات المطلوبة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية الدقيقة) للكولشيسين. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة. الجدول 2: Tانه المعلمات اللازمة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية micronuated) للميتوميسين C. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة. الجدول 3: البارامترات المطلوبة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية الدقيقة) للمانيتول. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة. الملحق 1: البروتوكول الكامل. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف. الملحق 2: قائمة القناع. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

وفي منشور صدر مؤخرا، أكد فيرما وآخرون على أهمية تطوير نظام يجمع بين ميزة الإنتاجية العالية لقياس التدفق والفوائد التخزينية للبيانات والصور لتحليل الصور35. وMIFC في المختبر MN الفحص الموصوفة في هذه الورقة يلبي هذا الاقتباس ولديه القدرة على التغلب على العديد من التحديات المذكورة أعلاه في المجهرية وتدفق أساليب قياس السيتومترية. ويبين البروتوكول الموصوف هنا أنه يمكن تقييم كل من السمية الخلوية والسمية الجينية باستخدام MIFC. إعداد العينات، تلطيخ الخلوية وجمع البيانات هي مباشرة ولكن هناك بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي ينبغي أن تنفذ دائما. إضافة كلوريد البوتاسيوم (KCl) إلى الخلايا أمر بالغ الأهمية لتضخم الخلايا، وتوليد الفصل بين النوى الرئيسية. وهذا يضمن أن خوارزمية الإخفاء يمكن تحديد كافة النوى الفردية في BNCs وخلايا POLY (خلايا POLY) وهو ضروري للتعداد الخاصة بهم. بالإضافة إلى ذلك، يوفر KCL الفصل بين النوى وMN، وهو أمر ضروري لاخفاء MN دقيقة وتكميم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام فورالين بعد إضافة KCl يمنع الخلايا من التسل أثناء الطرد المركزي. إضافة Cytochalasin B يسبب خلايا TK6 التي خضعت لأكثر من تقسيم نووي واحد لتكون كبيرة جدا. ونتيجة لذلك، يصبح السيتوبلازم هشًا ويمكن أن يُنفّذ إذا تم تنفيذ الطرد المركزي مباشرة بعد إضافة KCl. وعلاوة على ذلك، من المهم جدا إدخال Hoechst إلى العينة وفقا لعدد من الخلايا في العينة وليس وفقا لتركيز نهائي. على سبيل المثال، التركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل من Hoechst وصمة عار بشكل موحد عينة من 1 × 106 الخلايا ولكن قد لا وصمة عار كافية عينة تحتوي على 5 × 106 الخلايا ويمكن أن يؤدي إلى العديد من الخلايا مع نوى ملطخة بشكل خافت، مما يجعل التحليل من الصعب. من المهم أيضا أن نلاحظ أن Hoechst يمكن استبدالها بصبغة الحمض النووي الأخرى مثل DAPI إذا تم تجهيز MIFC مع الليزر الإثارة 405 نانومتر أو DRAQ5 إذا تم تجهيز MIFC مع 488 نانومتر و / أو 642nm ليزر الإثارة…. إذا تعديل وصمة عار النووية، فمن الأهمية بمكان لtitrate وصمة عار من أجل العثور على التركيز المناسب لقوة الليزر المطلوبة / المطلوبة.

عند جمع البيانات على MIFC من المهم تحديد حدود المنطقة المثلى لميزات RMS التدرج. وقد تتطلب الحدود المعروضة في هذا البروتوكول تعديلاً بسبب بعض الاختلافات الطفيفة بين صكوك اللجنة. إن تطبيق هذه الميزة أثناء جمع البيانات ضروري لضمان التقاط صور عالية التركيز. إذا كانت ملفات البيانات تحتوي على العديد من الصور غير الواضحة أو غير المركزة، فمن المحتمل أن خوارزميات الإخفاء في برنامج التحليل سوف تسلط الضوء بشكل غير صحيح على تلطيخ القطع الأثرية في المناطق غير الواضحة، مما يؤدي إلى عدد كبير من القطع الأثرية الإيجابية الزائفة التي يتم تسجيلها كـ MN. على الرغم من أن تقنيات معالجة الصور الموضحة هنا يمكن أن تكون صعبة، بمجرد تطوير قالب تحليل في برنامج MIFC، تسمح معالجة الدفعات بتحليل ملفات البيانات تلقائيًا، مما يلغي تدخل المستخدم وبالتالي، هداف التحيز. أيضا، إذا تم استخدام خط خلية غير خلايا TK6 لإجراء التصاق، سيكون من الضروري تعديل الأقنعة وحدود المنطقة حيث أن الخصائص المورفولوجية (مثل الحجم) للخلايا سوف تختلف عن خصائص خلايا TK6.

تظهر النتائج المعروضة هنا (الشكل5)زيادات كبيرة إحصائياً في الحث MN عند تعريض خلايا TK6 لجرعات مختلفة من ميتوميسين C وكولشيسين. ولوحظت زيادات كبيرة إحصائياً في تواتر النـزم النووي مقارنة بضوابط المذيبات لعدة جرعات في كلتا الجماتين الكيميائيتين. وبالإضافة إلى ذلك، لم تسبب أي جرعة من مانيتول سمية خلايا أكثر من 30٪، ولا زيادة كبيرة إحصائيا في تواتر MN بالمقارنة مع ضوابط المذيبات، كما هو متوقع. البروتوكول الموصوف في هذه الورقة باستخدام MIFC لإجراء اختبار MN في المختبر يعطي النتائج المتوقعة من كل من المواد الكيميائية الرقابة الإيجابية والسلبية. من المهم جداً إجراء عدد من التجارب باستخدام كل من ضوابط المذيبات والمواد الكيميائية للرقابة السلبية لتطوير قيم خط الأساس لكل من تواتر MN وكذلك مؤشر انتشار كتلة السيتوكينيسيس (CBPI). وفيما يتعلق بالسمية الجينية، تتحدد الزيادات الهامة إحصائياً في تردد الـ MN من خلال المقارنة مع ترددات الـ MN الأساسية التي يجب أن تكون معروفة بنوع الخلية المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، تستند جميع حسابات السمية الخلوية إلى CBPI لعينات التحكم، وبالتالي، يجب أن تكون معدلات خط الأساس لخلايا MONO وBNCs وPOLY محددة كمياً في الضوابط.

وقد تم وصف العديد من القيود والمزايا لاستخدام MIFC في سياق الاستفادة من MN في العمل السابق29،32. وتتعلق القيود الرئيسية بانخفاض ترددات الـ MN عند مقارنتها بالفحص المجهري، وهو ما قد ينتج عن انعدام المرونة عند تنفيذ معايير التهديف في برنامج التحليل وكذلك عن العمق المحدود لمجال الـ MIFC. يمكن إنشاء أقنعة محيطة بشكل جيد لتحديد الدقيق للنوى الرئيسية ولكن MN التي يتم لمس (أو قريبة جدا من) النوى الرئيسية قد يتم التقاطها داخل قناع BNC. بالإضافة إلى ذلك، MN صغيرة جداً التي يمكن تسجيلها بسهولة بدلاً من ذلك باستخدام الفحص المجهري ربما غاب بشكل غير صحيح عند استخدام MIFC بسبب الحد الأدنى على معلمة المنطقة من قناع MN لتجنب تسجيل القطع الأثرية الصغيرة. بالإضافة إلى الصعوبات الموجودة في تحليل البيانات المستندة إلى الصور، بسبب تصميمها، تحصل MIFC على صور إسقاط ثنائية الأبعاد للأجسام الخلوية ثلاثية الأبعاد. وهذا يؤدي على الأرجح إلى التقاط بعض MN في عمق مختلف من التركيز أن MN الرئيسيتين اثنين، مما يجعلها تبدو قاتمة جدا وغير قابلة للتآكل باستخدام اخفاء. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يقيم جزء صغير من الحركة الوطنية وراء إحدى النوى الرئيسيتين، مما يجعل من المستحيل تصورها وتسجيلها. ولذلك، وبالنظر إلى هذه الصعوبات، ينبغي توخي الحذر عند تفسير الزيادات الكبيرة في تواتر النيوم بالجرعات المنخفضة.

على الرغم من أوجه القصور هذه، فإن طريقة MIFC الموصوفة هنا تقدم العديد من المزايا على تقنيات أخرى. واقترح Fenech وآخرون المعايير والمبادئ التوجيهية التي ينبغي مراعاتها عند وضع نظم ومنهجيات آلية للاختبارات MN36. وتشمل هذه، على سبيل المثال لا الحصر، التصور المباشر للنوى الرئيسية والسيتوبلازم، وتحديد تواتر MN من جرعات مختلفة من المادة الكيميائية أو العوامل التي يجري اختبارها والقدرة على تكميم المورفولوجيا وتحديد موقف جميع النوى وMN للتأكد من أنها داخل السيتوبلازم. وتبين هذه الورقة أن طريقة MIFC التي تم تطويرها لإجراء الاختبار MN في المختبر يرضي (أو يملك القدرة على الوفاء) هذه المعايير. على وجه التحديد، يمكن التقاط صور للنوى وMN بواسطة الليزر الفلورسنت في حين يمكن الحصول على الصور السيتوبلازمية باستخدام الصمام BF. يمكن تمييز صور الخلايا ذات المورفولوجيا النووية العادية تلقائيًا عن تلك الخلايا ذات المورفولوجيا غير النظامية باستخدام مزيج من الأقنعة والميزات المتقدمة. تظهر النتائج المقدمة للكولشيسين وميتوميسين C (الشكل 5) أنه يمكن تقييم كل من السمية الجينية والسمية الخلوية بجرعات مختلفة بالمقارنة مع ضوابط المذيبات، وأن ترددات MN الهامة إحصائياً تُلاحظ حيث يتم ملاحظة ترددات MN الهامة إحصائياً حيث المتوقع. وعلاوة على ذلك، يوصي المبدأ التوجيهي للاختبار 487 لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي بتسجيل 000 2 من هذه الـ 000 2 من الـ BNCs لكل تركيز اختباري لتقييم وجود السمية الجينية لتحديد السمية الجينية إلى جانب ما لا يقل عن 500 خلية لكل تركيز اختباري لتحديد السمية الخلوية9؛ هذا يمكن أن يستغرق أكثر من 1 ساعة باستخدام المجهرية اليدوية. يظهر البروتوكول والنتائج في هذه الورقة أنه تم التقاط ما متوسطه حوالي 6000 BNCs و 16000 خلية MONO و800 خلية بولي وسجل كل تركيز اختبار في حوالي 20 دقيقة. ويبرز المعدل السريع لاقتناء البيانات والأعداد العالية من الخلايا المرشحة التي سجلت في مثل هذا الوقت القصير ميزة هامة أخرى هي استخدام MIFC لإجراء اختبار MN في المختبر.

وفي حين أن النتائج المعروضة في هذه الورقة مشجعة، فإنها تمثل طريقة مبكرة لإثبات المفهوم. وينبغي أن يعقب هذا العمل تحقيق أكثر شمولاً لمجموعة كيميائية أكبر وأكثر تنوعاً تغطي فئات وآليات متعددة للسمية الجينية والسمية الخلوية مثل تلك التي اقترحها كيركلاند وآخرون37 تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة، وتقع خارج نطاق هذه الورقة ومع ذلك، فإن هذه الدراسات على نطاق أوسع توفر نظرة ثاقبة قيمة في قدرة الطريقة لتحديد موثوق بها العوامل السامة للجينوية ضعيفة. ولم تُصغر المنهجية المعروضة هنا بعد في شكل ميكروويل، مما سيتيح فحصاً أسرع وأكثر كفاءة عبر نطاق جرعة أكبر. وعلى هذا النحو، قد يكون الفحص الذي يستند إلى MIFC في المختبر والموجود هنا مناسباً لدراسات المتابعة المكثفة أو البحث في الممارسات المختبرية الجيدة. ومع ذلك، فإن الطريقة سوف تستمر في الأمثل والتحقق من صحتها، وتمتلك القدرة على السماح لمزيد من المرونة في الكشف عن الأحداث الكيميائية المحددة المتعلقة مورفولوجيا، مثل التعرض aneugen الذي يزيد من نسبة الخلايا مع النوى غير الدائرية التي لا تزال قابلة للتآكل38. وأخيراً، تتيح طريقة MIFC فرصة لإدخال علامات بيولوجية إضافية في اختبار MN (مثل تلطيخ kinetochore) لتوفير رؤية أكثر شمولاً لآلية الحث MN.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وتشكر المؤلفة كريستين بروبست (شركة لومينيكس) على جهودها في تطوير الأشكال السابقة من قالب تحليل البيانات، وكذلك الدكتورة هالي بوغسلي (شركة لومينيكس) والدكتور موريسي (شركة لومينيكس) على استعراض وتحرير المخطوطه.

Materials

15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser – Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler – 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC – ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software – IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software – INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse – Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath – PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent – SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  2. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).
  3. Fenech, M. The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).
  4. Hintzsche, H., et al. Fate of micronuclei and micronucleated cells. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).
  5. Fenech, M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).
  6. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  7. Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. The HUman MicroNucleus Project – An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).
  8. Kirsch-Volders, M., et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).
  9. OECD Library. Test No. 487: In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2016).
  10. Aardema, M. J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).
  11. Clare, M. G., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).
  12. Lorge, E., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).
  13. Oliver, J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).
  14. Wakata, A., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).
  15. Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).
  16. Decordier, I., et al. Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring. Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).
  17. Decordier, I., et al. Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring. Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).
  18. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).
  19. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  20. Nüsse, M., Marx, K. Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).
  21. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  22. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).
  23. Bryce, S. M., et al. Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).
  24. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).
  25. Basiji, D. A. . Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  26. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).
  27. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry. Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).
  28. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).
  29. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).
  30. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay. Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).
  31. Wang, Q., et al. Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay. Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).
  32. Rodrigues, M. A. Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer. Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).
  33. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).
  34. Fenech, M., et al. HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).
  35. Verma, J. R., et al. Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells. Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).
  36. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  37. Kirkland, D., et al. Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).
  38. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).

Tags

In Vitro Micronucleus AssayMultispectral Imaging Flow CytometryAutomated MethodGenotoxicityCytotoxicityClastogensAneugensCell ExposureCytochalasin BPotassium ChlorideFormalinHoechst 33342High-throughputAutomated MicroscopyConventional Flow Cytometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image