זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה קלאסית הוקמה היטב בשימוש כדי לזהות רכיבים סלולריים או רקמות (אנטיגנים) על ידי הנוגדן אנטיגן אינטראקציה^1,2. ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הלוקליזציה וההפצה של biomolecules היעד בתוך הרקמה. IHC משתמשת בתגובות אימונולוגיים וכימיים כדי לזהות אנטיגנים בסעיפים רקמות³. הסמנים העיקריים המשמשים להדמיה של אינטראקציות אנטיגן-נוגדן כוללים צבעי פלורסנט (immunofluorescence) ו-המצע האנזים התגובות צבע (פרוקסידאז), שניהם מצוענים ל נוגדנים⁴. באמצעות תצפית מיקרוסקופית ניתן לקבוע את הלוקליזציה של רקמת התווית, אשר בקירוב מתאים ללוקליזציה של אנטיגן היעד ברקמה.

שתי שיטות קיימות עבור התגובות פלורסנט או כרומוגניים כדי לזהות חלבון: שיטת איתור ישירה, שבה הנוגדן העיקרי הספציפי מתויג ישירות; ואת השיטה לזיהוי עקיף, שבו הנוגדן העיקרי הוא בלתי מצומת בעוד הנוגדן המשני נושאת את התווית^5,6,7. לשיטה העקיפה יש כמה יתרונות, שהוא בעיקר הגברה האותות שלה. כמו-כן, בניגוד לטכניקות מולקולאריות אחרות של מולקולות וסלולר, ניתן לדמיין את ההפצה, הלוקליזציה והביטוי של שני חלבונים או יותר המתבטאים בתוך תאים ורקמות⁷. בחירת שיטת האיתור המשמשת בשימוש תלויה בפרטים הניסיוניים.

עד כה, IHC משמשת רבות במחקר בסיסי ככלי רב עוצמה וחיוני כדי להבין את ההפצה והלוקליזציה של סמנים ביולוגיים ואת הפרופיל הכללי של חלבונים שונים ברקמות ביולוגיות מאדם לחסרי חוליות^8, מיכל בן ^{10 ,} מיכל ^{עשור , 11}. הטכניקה מסייעת להציג מפה של ביטוי החלבון במספר רב של אברי בעלי חיים רגילים ושונים וסוגי רקמות שונות, המראים אפשרות כלפי מטה או מעלה ביטוי הנגרם על-ידי שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים. IHC היא טכניקה רגישה מאוד הדורשת דיוק ובחירה נכונה של שיטות להשגת תוצאות אופטימליות¹². קודם כל, גורמים שונים רבים כגון קיבעון, לחצות את הפעילות, לאחזור אנטיגן, ורגישות של נוגדנים יכול להוביל שווא חיובי שווא אותות שליליים¹³. בחירת הנוגדנים היא אחד השלבים החשובים ביותר ב-IHC והיא תלויה במגוון האנטיגן ובזיקה לחלבון ולמינים הנמצאים תחת חקירה⁷.

לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה של הטכניקה ihc כדי לזהות חברים של orexin/היפושנון מערכות אנדוקנאיאיד בתוך רקמת מבוגרים דג זברה. אנו מתמקדים בעיקר על קיבוע, רקמה הטבעה באמצעות שתי גישות שונות, הפרדה והרכבה (אשר יכול להשפיע על החלטה ופרטים במהלך ניתוח מיקרוסקופיים), חסימה (כדי למנוע תוצאות חיוביות שווא ולהפחית את הרקע)¹⁴. מאפיינים חשובים אחרים הם הנוגדנים מפרט ובסלקטיביות והשכולים של פרוטוקולים IHC בודדים. המפתח למתן ספציפיות נוגדן הוא השימוש של פקדים שליליים (כולל לא נוגדנים הראשי או רקמות כי ידוע לא לבטא את החלבונים היעד), כמו גם פקדים חיוביים (כולל רקמות כי ידוע לבטא את החלבונים היעד)¹⁵ . בחירת נוגדנים עבור ihc מבוססת על בסיס המינים שלהם-ספציפיות (הסבירות שבה הם מגיבים עם אנטיגן של עניין) ואת אנטיגן-נוגדן מערכות זיהוי מחייב המשמש^{4,5,6 ,7}. במקרה של פרוקסידאז, הצבע של התגובה נקבע על ידי הבחירה של כרומוגן התלול, בדרך כלל diaminobenzidine (חום)¹⁶. מצד שני, אנימשתמש בנוגדנים בעלי מצועם עם פלואורופראור כדי להמחיש ביטוי חלבון במקטעים של רקמות קפואות ומאפשר ניתוח קל של חלבונים מרובים ביחס למערכת האיתור הרומוגנית מיכל ^{5 , 7}. לאחר מכן

בטכניקת פרוקסידאז, הנוגדן המשני הוא מעלה באוב כדי biotin, מולקולה מקשר מסוגל לגייס מולקולה עיתונאי כרומוגניים [avidin-biotin קומפלקס (ABC)], המוביל הגברה של האות מכתים. עם שיטת העיתונאי ABC, האנזים peroxidase מגיב עם 3, 3 ‘-diaminobenzidine (בתוספת), הפקת כתמים בצבע חום אינטנסיבי שבו האנזים נקשר הנוגדן המשני, אשר ניתן לנתח עם מיקרוסקופ אור רגיל. כתמים ABC, בשל הזיקה הגבוהה של אבידין עבור biotin, מייצרת תגובה מהירה ואופטימלית, עם כמה נוגדנים משניים המחוברים לאתר של הנוגדן העיקרי הפעילות. שיטת זיהוי כרומוגניים זו מאפשרת ניתוח הדסיטומטלי של האות, המספקת נתונים חצי כמותיים המבוססים על התאמה של רמות האות החום עם ביטוי חלבון רמות¹⁸.

עם שיטות immunofluorescence גילוי סימולטני של חלבונים מרובים אפשרי בשל היכולת של fluorochromes שונים כדי לפלוט אור באורכי גל ייחודיים, אבל חשוב לבחור fluorochromes בזהירות כדי למזער חפיפה ^{ספקטרלית 5}. יתר על כן, השימוש בנוגדנים העיקריים במינים מארחים שונים ממזער את הקשיים הנוגעים לפעילות החוצה. במקרה זה, כל מיני-נוגדן משני ספציפי מזהה רק סוג אחד של נוגדן ראשוני. כתבים פלואורסצנט הם מולקולות אורגניות קטנות, כולל נגזרים מסחריים, כגון אלקסה פלואו צבעים.

מודלים רבים של בעלי חיים משמשים להבנת מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים מסוימים. עד כה, הוא הוקם כי מסלולים מטבולית רבים נשמרים במהלך האבולוציה. לכן, מחקרי IHC במודלים של אורגניזמים כגון מצדגים יכולים לספק תובנה לבראשית ולתחזוקה של מצבים פתולוגיים ובלתי פתולוגיים¹⁷. זוהי מטרת דו ח זה כדי להמחיש פרוטוקולים ihc כי ניתן לבצע על רקמת דג זברה למבוגרים ולהשתמש כדי לקבל תמונות מפורטות של הפצה ולוקליזציה של oxa, OX-2r, ו CB1R ברמות היקפיים והמרכזי. דווח גם הם פרוטוקולים עבור יישום של שתי שיטות הגדולות IHC עקיף ברקמות היקפיים והמרכזית של דג מבוגר. מתוארים היא שיטה עקיפה, אשר מאפשרת הגברה האות במקרים שבהם נוגדן משני מצומת לצבוע פלורסנט (שיטת החיסונית) או כתב אנזים (פרוקסידאז שיטה). הן כרומוגניים והן שיטות זיהוי פלורסנט בעלי יתרונות וחסרונות. מדווח בפרוטוקול זה הוא השימוש ב-IHC, בעיקר במערכת החיסונית, מדגם בעלי חיים הנפוץ ביותר ללימוד מערכות ההתפתחותיות בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים.