Oksidatif stres nedeniyle Mitis grubu streptokok Caenorhabditis elegans içinde eğitim
Summary
Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans ana bilgisayar-patojen etkileşimleri incelemek için mükemmel bir modeldir. Burada açıklanan solucan mitis grubu streptokok üyeleri ile enfekte ve oksidatif stres tepkisi bu grup organizmalar tarafından üretilen H2O2 karşı aktivasyonu belirlemek için bir iletişim kuralıdır.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), yaşayan bir yuvarlak solucanlar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitim için çekici bir model ortaya çıkmıştır. Sunulan Protokolü mitis grubu streptokok H2O2üretim yoluyla neden patojenitesi belirlemek için bu modeli kullanır. Mitis grubu streptokok bakteriyemi, endokardit ve orbital sellülit gibi birçok insan hastalığa neden ortaya çıkan bir tehdit vardır. Burada açıklanan bu solucanların H2O2 yanıt olarak yaşama belirlemek için bir protokol patojenler bu grup tarafından üretilmektedir. Gen skn-1 bir oksidatif stres yanıt transkripsiyon faktörü için kodlamayı kullanarak, bu model Streptokok enfeksiyonu karşı gerekli olan ana bilgisayar genlerin tanımlamak için önemlidir gösterilir. Ayrıca, etkinleştirme oksidatif stres yanıtının SKN-1 yeşil flüoresan protein (GFP) eritilmiş olan bir transgenik muhabir solucan yük kullanarak bu patojenler huzurunda izlenebilir gösterilir. Bu deneyleri fırsat oksidatif stres tepkisi H2O2 exogenously olarak biyolojik bir kaynak tarafından elde edilen çalışma Reaktif oksijen türleri (ROS) kaynakları ek sağlamak.
Introduction
Mitis grubu streptokok oropharyngeal boşluğu1insan commensals vardır. Ancak, bu organizmaların bu niş kaçış ve invazif hastalıkları2çeşitli neden. Bu mikroorganizmalar tarafından neden olduğu enfeksiyonlar bakteriyemi, endokardit ve orbital sellülit2,3,4,5,6içerir. Ayrıca, kan dolaşımına enfeksiyonlar olarak sorumlu ajanlar ortaya çıkıyor içinde immün, Nötropenik ve kemoterapi5,7,8,9 uğramıştır kanserli hastalarda .
Mekanizmaları temel mitis grup Patogenez olduğunu belirsiz, çünkü birkaç virülans faktörleri tespit edilmiştir. Mitis grup oral mikrobiyal topluluklar10içinde önemli bir rol oynamaya göstermiştir H2O2, üretmek için bilinir. Daha yakın zamanlarda, çeşitli çalışmalarda H2O2 için rol epitel hücre ölüm11,12indükler bir Sitotoksin olarak çizer. Bu gruba ait S. pnömoni, DNA hasarı ve alveoler hücreleri13‘ te apoptosis indükler H2O2 yüksek düzeyde üretmek için kanıtlanmıştır. Bir akut pnömoni hayvan modeli kullanarak, aynı araştırma H2O2 bakteri tarafından üretimi virülans avantaj confers göstermek. Pnömokok menenjit çalışmaları da bu patojen kaynaklı H2O2 sinerjik nöronal hücre ölüm14tetiklemek için pneumolysin ile hareket göstermiştir. Bu gözlemler açıkça kurmak için onların patojen bakteri bu grubu tarafından üretilen bu H2O2 önemlidir.
İlginçtir, bu da grubunun üyeleri mitis S. mitis ve oralis S. neden H2O215,16üretimi yoluyla nematodunun C. elegans ölümü gösterilmiştir. Bu evrimleşmiş Yuvarlak solucanlar birçok biyolojik süreçlerin çalışmaya basit, genetik olarak uysal model olarak kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, solucan ana bilgisayar-patojen etkileşimleri17,18eğitim için bir model olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda oksidatif stres bu organizma19,20,21kullanarak okuyan önemini çizer. Onun kısa hayat döngüsü, yetenek RNAi tarafından ilgi devirme genler ve yeşil flüoresan protein (GFP) kullanımı-gen ekspresyonu izlemek için yuvarlak gazetecilere bir çekici model sistemi yapmak öznitelikleri bazılarıdır. Daha da önemlisi, oksidatif stres ve solucan doğuştan gelen bağışıklık düzenleyen yolları memeliler20,22ile son derece korunmuş.
Bu protokol için o C. elegans streptokok kaynaklı H2O2tarafından neden patojenitesi aydınlatmak için nasıl kullanılacağı gösterilmiştir. Değiştirilmiş hayatta kalma tahlil gösterilir ve mitis grubunun üyeleridir solucanlar hızla öldürmek mümkün yoluyla üretim H2O2. Reaktif oksijen türleri sürekli biyolojik kaynağı mitis grubunun üyeleri kullanarak (ROS), aksine solucanlar oksidatif stres neden kimyasal kaynaklardan sağlanır. Ayrıca, bakteri H2O2 (çeşitli engelleri geçmek zorunda diğer kaynaklarına göre) bağırsak hücrelere doğrudan hedef hangi sağlar hızla, solucanlar kolonize edebiliyoruz. Tahlil ya 1) tarafından belirlenmesi skn-1 mutant suşu veya 2) tarafından aşağı RNAi solucanlar N2 vahşi-türü göreli ve vektör kontrol tedavi solucanlar kullanma skn-1 eleştiri hayatta kalma doğrulanır. SKN-1 C. elegans23,24,25oksidatif stres yanıtında düzenleyen bir önemli transkripsiyon faktörü var. Hayatta kalma deneyleri ek olarak, bir SESN-1B/C::GFP transgenik muhabir ifade bir solucan yük mitis grupla aktivasyonu oksidatif stres yanıt yolu ile H2O2 üretim izlemek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan yöntemleri de üreten anaerobik altında yetiştirilen H2O2 Enterococcus faeciumgibi diğer Patojen bakteriler için kullanılabilir ya da mikroaerofilik koşulları26. Genellikle, en patojenik organizmalar için bu hafta için hayatta kalma deneyleri tamamlamak için birkaç gün sürer. Ancak, H2O2 mitis grubunun üyeleri tarafından sağlam üretim nedeniyle, bu deneyleri içinde 5-6 h açıklanan koşullar altında tamamlanamad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (University of Texas, diş hekimliği Okulu), teşekkür Dr Richard Lamont (Louisville Üniversitesi, diş hekimliği Okulu) ve Dr. Samuel laboratuar ve klinik suşları sağlamak için Shelburne (MD Anderson Kanser Merkezi) mitis grubu Streptokok. Ayrıca Dr. Keith Blackwell (genetik bölümü, Harvard Tıp Okulu) C. elegans suşları için teşekkür ediyoruz. Son olarak, biz Dr Danielle Garsin ve onun lab (University of Texas, McGovern Tıp Fakültesi) reaktifler ve solucan suşları çalışma yapmak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bazı solucan suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned–microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
