Estudiar el estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans
Summary
El nematodo Caenorhabditis elegans es un excelente modelo para disecar interacciones huésped-patógeno. Se describe aquí es un protocolo para infectar el gusano con los miembros de los estreptococos del grupo mitis y determinar la activación de la respuesta de estrés oxidativo contra H2O2 producido por este grupo de organismos.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematodo de vida libre, se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El protocolo presentado utiliza este modelo para determinar la patogenicidad causada por los estreptococos del grupo mitis a través de la producción de H2O2. Los estreptococos del grupo mitis son una amenaza emergente que causan muchas enfermedades en humanos tales como bacteremia, endocarditis y celulitis orbitaria. Se describe aquí es un protocolo para determinar la supervivencia de estos gusanos en respuesta a H2O2 producido por este grupo de patógenos. Usando la codificación de skn-1 gen para un factor de transcripción de respuesta de estrés oxidativo, se muestra que este modelo es importante para la identificación de genes de host que están esenciales contra la infección estreptocócica. Además, está demostrado que la activación de la respuesta de estrés oxidativo se puede supervisar en presencia de estos patógenos utilizando una cepa de gusano reportero transgénicos, en la que SKN-1 está fusionada a la proteína verde fluorescente (GFP). Estos ensayos ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta de estrés oxidativo a H2O2 derivado de una fuente biológica como contraposición a exógeno agregado fuentes de oxígeno reactivo (ROS) las especies.
Introduction
Estreptococos del grupo mitis son humanos comensales de la cavidad bucofaríngea1. Sin embargo, estos organismos pueden escapar de este lugar y causar una variedad de enfermedades invasivas2. Las infecciones causadas por estos microorganismos incluyen bacteriemia, endocarditis y celulitis orbitaria2,3,4,5,6. Por otra parte, ellos surgen como agentes de infecciones del torrente sanguíneo en neutropénicos, inmunodeprimidos y pacientes con cáncer que han sufrido quimioterapia5,7,8,9 .
Los mecanismos de patogénesis de grupo mitis subyacente es ocultar, porque se han identificado algunos factores de virulencia. El grupo mitis se conoce para producir H2O2, que ha demostrado que juegan un papel importante en las comunidades microbianas orales10. Más recientemente, varios estudios han puesto de manifiesto una función de H2O2 como una citotoxina que induce muerte de células epiteliales11,12. Neumonía por S. que pertenece a este grupo, se ha demostrado para producir altos niveles de H2O2 que induce daño en el ADN y la apoptosis en células alveolares13. Utilizando un modelo animal de neumonía aguda, los mismos investigadores demostraron que la producción de H2O2 por las bacterias confiere una ventaja de virulencia. Estudios sobre la meningitis neumocócica también han demostrado que derivados del patógeno H2O2 actúa sinérgicamente con inmunoprotectores para accionar la célula neuronal muerte14. Estas observaciones establecen claramente que H2O2 producido por este grupo de bacterias es importante para su patogenicidad.
Curiosamente, también ha sido demostrado que miembros de la mitis grupo S. mitis y S. oralis causa muerte de los nematodos C. elegans mediante la producción de H2O215,16. Este nematodo de vida libre se ha utilizado como un modelo simple, genéticamente manejable para el estudio de muchos procesos biológicos. Más recientemente, el gusano ha emergido como un modelo para el estudio de17,de las interacciones huésped-patógeno18. Además, varios estudios han puesto de relieve la importancia de estudiar el estrés oxidativo mediante este organismo19,20,21. Su ciclo de vida corto, capacidad de precipitación genes de interés por ARNi y el uso de la proteína verde fluorescente (GFP)-Reporteros fundidos para monitorizar la expresión génica son algunos de los atributos que lo convierten en un sistema modelo atractivo. Más importante aún, las vías que regulan el estrés oxidativo y la inmunidad innata en el gusano están muy conservadas con mamíferos20,22.
En este protocolo, se demuestra cómo utilizar C. elegans para dilucidar la patogenicidad causada por estreptococos derivados H2O2. Se muestra un análisis de supervivencia modificado, y los miembros del grupo mitis son capaces de matar los gusanos rápidamente a través de la producción de H2O2. Con miembros del grupo mitis, una fuente biológica sostenida de especies reactivas del oxígeno (ROS) cuenta, a diferencia de fuentes químicas que inducen estrés oxidativo en los gusanos. Además, las bacterias son capaces de colonizar rápidamente, los gusanos que permite H2O2 a dirigirse directamente a las células intestinales (en comparación con otras fuentes que tienen que cruzar varias barreras). El ensayo es validado o 1) por determinación de la supervivencia de la cepa mutante de skn-1 o 2) por derribar skn-1 utilizando RNAi en gusanos en relación con el N2 de tipo salvaje y vector control tratado gusanos. SKN-1 es un factor de transcripción importante que regula la respuesta al estrés oxidativo en C. elegans23,24,25. Además de análisis de supervivencia, una cepa de gusano expresando un reportero transgénico SKN-1B/C::GFP se utiliza para controlar la activación de la estrés oxidativo respuesta a través de la producción de H2O2 por el grupo mitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos pueden ser utilizados para otras bacterias patógenas tales como Enterococcus faecium, que también produce H2O2 en anaerobios o microaerofílicos condiciones26. Por lo general, para más patógenos, lleva varios días a semanas para completar el análisis de supervivencia. Sin embargo, debido a la robusta producción de H2O2 por miembros del grupo mitis, estos ensayos podrían completarse dentro de 5-6 h en las condicione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (la Universidad de Texas, escuela de Odontología), Dr. Richard Lamont (Universidad de Louisville, Facultad de Odontología) y Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) laboratorio y cepas clínicas de los estreptococos del grupo mitis. También agradecemos a Dr. Keith Blackwell (Departamento de genética, escuela de medicina de Harvard) para las cepas de C. elegans . Finalmente, agradecemos a su laboratorio (la Universidad de Texas, escuela de medicina de McGovern) y Dr. Danielle Garsin para proporcionar reactivos y cepas de gusano para realizar el estudio. Algunas cepas de gusano fueron proporcionados por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440).
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
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