Изучения оксидативного стресса, вызванного стрептококки группы Mitis в Caenorhabditis elegans
Summary
Нематоды Caenorhabditis elegans является прекрасной моделью для рассечения хост возбудитель взаимодействий. Описанные здесь — это протокол для заразить червь с членами mitis стрептококки группы и определения активации окислительного стресса ответ против H2O2 подготовленные этой группой организмов.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), Свободноживущие нематоды, стала привлекательной модель для изучения взаимодействия хост патогена. Представленные протокол использует эту модель для определения патогенности, вызванных стрептококки группы mitis через производство H2O2. Стрептококки группы mitis являются возникающие угрозы, что причиной многих заболеваний человека как бактериемия, эндокардите и орбитального целлюлита. Описанные здесь протокол для определения выживание этих червей в ответ H2O2 производится по этой группе патогенов. В кодировке гена skn-1 для окислительного стресса ответ транскрипционный фактор, показано, что эта модель имеет важное значение для идентификации узла генов, которые необходимы против стрептококковой инфекции. Кроме того показано, что активации реакции окислительного стресса могут контролироваться в присутствии этих патогенов с помощью штамм червь трансгенных репортер, в котором SKN-1 сливается с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП). Эти анализы обеспечивают добавлена возможность для изучения оксидативного стресса ответ H2O2 экзогенно получаемых биологический источник в отличие от реактивнооксигенных видов (ров) источников.
Introduction
Стрептококки группы Mitis являются человеческие Комменсалами орофарингеальной области полости1. Однако эти организмы могут избежать этой ниши и вызывают различные заболевания инвазивным2. Инфекции, вызванные эти микроорганизмы включают бактериемии, эндокардите и орбитального целлюлита2,3,4,5,6. Кроме того, они появляются как возбудителей инфекций кровотока в нейтропенических с ослабленным иммунитетом и больных раком, которые прошли химиотерапию5,,78,9 .
Механизмы, основные группы патогенеза mitis скрывать, потому что было выявлено несколько факторов вирулентности. Известно, что группа mitis производят H2O2, который показал, чтобы играть важную роль в устной микробных сообществ10. Совсем недавно несколько исследований показали роль H2O2 как cytotoxin, которая вызывает эпителиальных клеток смерть11,12. Было показано, что S. пневмонии, которая принадлежит к этой группе, производят высокий уровень H2O2 , которая вызывает повреждение ДНК и апоптоз в альвеолярных клеток13. Использование животной модели острой пневмонии, же исследователи показали, что производство H2O2 бактериями дает преимущества вирулентности. Исследования по пневмококковой инфекции менингит также показали, что возбудитель производные H2O2 действует синергически с pneumolysin для запуска нейрональных клеток смерть14. Эти наблюдения четко установить, что подготовленные этой группой бактерий H2O2 имеет важное значение для их патогенности.
Интересно, что он также было показано что члены mitis группы S. mitis и S. oralis вызывают смерть нематоды C. elegans через производство H2O215,16. Это Свободноживущие нематоды использовался как простой, генетически шансов справиться с возникающими модель для изучения многих биологических процессов. Совсем недавно червь стала моделью для изучения хост возбудитель взаимодействия17,18. Кроме того некоторые исследования показали важность изучения оксидативного стресса, используя этот организм19,,2021. Его короткий жизненный цикл, способность после нокдауна генов интерес к RNAi и использование зеленого флуоресцентного белка (ГПУП)-плавленый репортеров для мониторинга экспрессии генов являются одними из атрибутов, которые делают его привлекательным модели системы. Что еще более важно пути, которые регулируют оксидативного стресса и врожденный иммунитет в червь высоко консервируют с млекопитающих20,22.
В этом протоколе показано, как использовать C. elegans для выяснения патогенности, вызванных стрептококками производные H2O2. Показано изменение выживания пробирного, и члены группы mitis способны убить черви быстро через производство H2O2. С помощью членов группы mitis, устойчивый биологический источник реактивнооксигенных видов (ROS) при условии, в отличие от химических источников, которые вызывают Оксидативный стресс в глистах. Кроме того бактерии способны колонизировать черви быстро, что позволяет для H2O2 быть непосредственно направлены на кишечные клетки (по сравнению с другими источниками, которые должны пересечь несколько барьеров). Assay проверяется либо 1) путем определения выживания мутантный штамм skn-1 или 2), стучать вниз skn-1 с помощью РНК-интерференции в червей по отношению к N2 одичал тип и вектор управления лечение глистов. SKN-1 является важным транскрипционный фактор, который регулирует оксидативного стресса ответ в C. elegans23,24,25. Помимо выживания анализов червь штамм, выражая трансгенных репортер SKN-1B/C::GFP используется для отслеживания активации окислительного стресса ответ через производство H2O2 mitis группой.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные методы могут использоваться для других патогенных бактерий, таких как Enterococcus faecium, который также производит H2O2 выращиваемой в анаэробных или микроаэрофильных условиях26. Как правило для самых патогенных организмов, она занимает несколько дней, н?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Бинг-Ян Ванг, доктор гена Трибл (Техасский университет, Школа стоматологии), д-р Ричард Ламонт (Луисвиллский университет, Школа стоматологии) и д-р Самуил Shelburne (MD Anderson Cancer Center) для предоставления лабораторных и клинических штаммов mitis стрептококки группы. Мы также благодарим д-р Кит Blackwell (Кафедра генетики, Гарвардской медицинской школы) для штаммов C. elegans . Наконец мы благодарим д-р Даниэль Garsin и ее лаборатории (университета Техаса, Макговерн медицинская школа) за предоставление реагентов и червь штаммов для проведения исследования. Некоторые штаммы червя были предоставлены CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440).
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned–microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
