לימוד לחץ חימצוני נגרם על-ידי Streptococci קבוצה מיטיס ב Caenorhabditis elegans
Summary
תולעים נימיות Caenorhabditis elegans הוא מודל מצוינת לנתח פתוגן-פונדקאי אינטראקציות. המתוארים כאן הוא פרוטוקול להדביק את התולעת עם חברי streptococci קבוצה מיטיס ולקבוע ההפעלה של התגובה סטרס חמצוני נגד H2O2 המיוצר על ידי קבוצה זו של אורגניזמים.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי, התפתחה מודל אטרקטיבי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. פרוטוקול הציג משתמשת מודל זה כדי לקבוע את פתוגניות הנגרמת על ידי streptococci קבוצה מיטיס דרך הייצור של2O H2. Streptococci קבוצה מיטיס הם איום המתעוררים הגורמות למחלות רבות כגון בקטרמיה, דלקת פנים הלב, צלוליטיס מסלולית. המתוארים כאן פרוטוקול כדי לקבוע את ההישרדות של תולעים אלה בתגובה2O H2 המיוצר על ידי הקבוצה של פתוגנים. באמצעות קידוד skn-1 ג’ין עבור גורם שעתוק של התגובה סטרס חמצוני, הוא הראה כי מודל זה חשוב לזיהוי גנים המארח החיוניים מפני זיהום streptococcal. יתר על כן, הוא הראה כי ניתן לנטר ההפעלה של התגובה סטרס חמצוני בנוכחות פתוגנים אלה באמצעות זן תולעת כתב מהונדס, שבו SKN-1 היא דבוקה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). מבחני אלה מספקים הזדמנות ללמוד את סטרס חמצוני בתגובה2O H2 נגזר על ידי מקור ביולוגי בניגוד exogenously הוסיף מקורות (ROS) מינים חמצן תגובתי.
Introduction
מיטיס קבוצה streptococci הם commensals האנושי של חלל הלוע התחתון1. עם זאת, אורגניזמים אלה ניתן לברוח הנישה הזאת, לגרום למגוון של מחלות פולשניות2. זיהומים הנגרמים על ידי מיקרואורגניזמים אלה כוללים בקטרמיה, דלקת פנים הלב ו צלוליטיס מסלולית2,3,4,5,6. יתר על כן, הם מתגלים סוכנים סיבתי כמו של מחזור הדם זיהומים בתוך neutropenic immunocompromised, ולאחר חולי סרטן שעברו טיפול כימותרפי5,7,8,9 .
מנגנוני פתוגנזה קבוצה מיטיס המשמש כבסיס הוא מעורפל, כי זוהו מספר גורמים התקפה אלימה. הקבוצה מיטיס ידוע לייצר H2O2, אשר הראו לשחק תפקיד חשוב קהילות מיקרוביאלי אוראלי10. לאחרונה, מספר מחקרים הראו תפקיד עבור H2O2 כמו cytotoxin שגורם תאים אפיתל מוות11,12. S. דלקת ריאות, אשר שייך לקבוצה זו, הוכח לייצר רמות גבוהות של2O H2 שגורם נזק לדנ א של אפופטוזיס בתאים מכתשי13. שימוש במודל חיה דלקת ריאות חריפה, אותם חוקרים הראו כי הייצור של2O H2 על ידי החיידקים מקנה יתרון התקפה אלימה. מחקרים על דלקת קרום המוח pneumococcal הראו גם שאת הפתוגן, נגזר H2O2 פועל בסינרגיה עם pneumolysin כדי לעורר דופאמינרגיים המוות14. תצפיות אלה לקבוע בבירור את2O H2 המיוצר על ידי קבוצת חיידקים חשוב עבור פתוגניות שלהם.
מעניין, גם הוכח כי חברי מיטיס הקבוצה מיטיס ס , ס’ oralis לגרום למוות של נמטודות C. elegans דרך הייצור של H2O215,16. תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי זה שימש כמודל פשוטה, צייתן גנטית ללמוד תהליכים ביולוגיים רבים. לאחרונה, התולעת התפתחה כמודל ללמוד פתוגן-פונדקאי אינטראקציות17,18. בנוסף, מספר מחקרים הדגישו את החשיבות של לימוד לחץ חימצוני באמצעות זה אורגניזם19,20,21. מחזור חיים קצר שלו, היכולת תמונות ציפורים הגנים של עניין על-ידי RNAi, ושימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-הכתבים מאוחה כדי לפקח על ביטוי גנים, חלק תכונות שהופכות אותו מערכת מודל אטרקטיבי. חשוב מכך, המסלולים המסדירים סטרס חמצוני, מולדת חסינות של התולעת מאוד נשמרים עם יונקים20,22.
ב פרוטוקול זה, הוכח כיצד להשתמש C. elegans התירי את פתוגניות נגרם על-ידי streptococcal-derived H2O2. וזמינותו להישרדות ששונה מוצג, חברי הקבוצה מיטיס מסוגלים להרוג את התולעים במהירות דרך הייצור של2O H2. באמצעות חברי הקבוצה מיטיס, מקור ביולוגי מתמשכת של מינים חמצן תגובתי (ROS) מסופק, לעומת מקורות כימי זירוז סטרס חמצוני של התולעים. יתר על כן, החיידקים מסוגלים ליישב את התולעים במהירות, מה שמאפשר עבור2O H2 להיות ממוקד ישירות אל תאי המעי (לעומת מקורות אחרים צריך לחצות את המחסומים מספר). וזמינותו מאומת גם 1) קביעת ההישרדות של המתח מוטציה skn-1 או 2) על-ידי הורסים skn-1 באמצעות RNAi תולעים ביחס N2 פראי-סוג ותולעים שליטה מטופלים וקטור. SKN-1 הוא גורם שעתוק חשובים המסדירה את תגובת לחץ חימצוני ב- C. elegans23,24,25. בנוסף מבחני הישרדות, זן תולעת לבטא כתב מהונדס SKN-1B/C::GFP משמש כדי לפקח על ההפעלה של סטרס חמצוני תגובה דרך הייצור של H-2-O-2 ע י קבוצת מיטיס.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן להשתמש בשיטות המתוארות חיידקים פתוגניים אחרים כגון Enterococcus faecium, המייצרת גם את2O H2 גדל תחת אנאירובי או microaerophilic תנאים26. בדרך כלל, עבור אורגניזמים פתוגניים ביותר, זה לוקח מספר ימים עד שבועות כדי להשלים את מבחני הישרדות. עם זאת, עקב ייצור חזקות של2O H2</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר בינג-יאן וואנג, ד ר ג’ינה Tribble (אוניברסיטת טקסס, בית הספר לרפואת שיניים), ד ר ריצ’רד למונט (אוניברסיטת לואיוויל, בית הספר לרפואת שיניים), ד ר סמואל Shelburne (MD Anderson Cancer Center) עבור מתן מעבדה קלינית זנים של מיטיס קבוצת streptococci. אנו מודים גם ד ר קית בלקוול (במחלקה לגנטיקה, הרוורד) עבור זנים C. elegans . לבסוף, אנו מודים ד ר דניאל Garsin, המעבדה שלה (אוניברסיטת טקסס, מבית הספר לרפואה מקגוורן) לאספקת ריאגנטים וללחצים תולעת לערוך את המחקר. כמה זנים תולעת נמסרו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440).
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned–microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
