دراسة "عنصر مؤكسد الإجهاد الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس" في ايليجانس كاينورهابديتيس
Summary
ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس نموذج ممتاز تشريح التفاعلات المضيف الممرض. الموصوفة هنا بروتوكول تصيب الدودة مع أعضاء العقديّات المجموعة ميتس وتحديد تنشيط استجابة الأكسدة ضد ح2س2 التي تنتجها هذه المجموعة من الكائنات الحية.
Abstract
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس)، ديدان أسطوانية الشرانق، برز كنموذج جذاب لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض. يستخدم البروتوكول قدم هذا النموذج لتحديد الأمراض التي تسببها الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس عبر إنتاج ح2س2. هي العقديّات المجموعة ميتس تهديد الناشئ الذي يسبب الكثير من الأمراض البشرية مثل تجرثم والتهاب الشغاف الخلوي المدارية. الموصوفة هنا هو بروتوكول لتحديد بقاء هذه الديدان في الاستجابة إلى ح2س2 التي تنتجها هذه المجموعة من العوامل الممرضة. استخدام الترميز skn-1 الجينات لعامل نسخ استجابة الأكسدة، ويتضح أن هذا النموذج مهم لتحديد الجينات المضيف الأساسية ضد العدوى العقدية. وعلاوة على ذلك، يتضح أن تنشيط استجابة الأكسدة يمكن رصد حضور هذه العوامل الممرضة باستخدام سلالة دودة مراسل المحورة وراثيا، التي هي تنصهر SKN-1 للبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). هذه الاختبارات توفير الفرصة لدراسة رد الأكسدة إلى ح2س2 المستمدة من مصدر بيولوجية كمقابل لمناشئ إضافة مصادر الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية.
Introduction
العقديّات المجموعة ميتس كومينسالس البشرية من تجويف المكنسية1. ومع ذلك، يمكن الهروب هذا مكانة هذه الكائنات وتسبب مجموعة متنوعة من الأمراض الغازية2. وتشمل الإصابات الناجمة عن هذه الكائنات المجهرية تجرثم والتهاب الشغاف الخلوي المدارية2،3،4،،من56. وعلاوة على ذلك، أنها تبرز وكلاء المسببة لالتهابات مجرى الدم في نيوتروبينيك المناعة، ومرضى السرطان التي خضعت للعلاج الكيميائي5،،من78،9 .
الآليات التي تحجب ميتس الكامنة وراء المجموعة المرضية، لأنه قد تم تحديد عدة عوامل الفوعة. مجموعة ميتيس المعروف لإنتاج ح2س2، والتي أظهرت أن تلعب دوراً هاما في المجتمعات الميكروبية الشفوي10. في الآونة الأخيرة، وقد أبرزت عدة دراسات دوراً ح2س2 سيتوتوكسين أن يستحث الخلايا الظهارية وفاة11،12. لقد ثبت س. الالتهاب الرئوي، الذي ينتمي إلى هذه المجموعة، لإنتاج مستويات عالية من ح2س2 أن يدفع ضرر الحمض النووي والمبرمج في الخلايا السنخية13. باستخدام نموذج حيوان للالتهاب رئوي حاد، أظهر الباحثون نفس أن إنتاج ح2س2 بواسطة البكتيريا يمنح ميزة ضراوة. وقد أظهرت الدراسات في التهاب السحايا المكوّرات الرئوية أيضا تلك المستمدة من الممرض ح2س2 أفعال تآزر مع بنيوموليسين تؤدي إلى موت الخلايا العصبية14. بوضوح هذه الملاحظات أن2س ح2 التي تنتجها هذه المجموعة من البكتيريا مهم لتلك القدرة الإمراضية.
من المثير للاهتمام، كما ثبت أن أعضاء ميتيس فريق ميتيس س. وس فموية تسبب وفاة السلكية C. ايليجانس عن طريق إنتاج ح2س215،16. هذا ديدان أسطوانية الشرانق قد استخدمت كنموذج بسيط، تتبعها وراثيا لدراسة العديد من العمليات البيولوجية. في الآونة الأخيرة، برز الدودة كنموذج لدراسة المضيف الممرض التفاعلات17،18. وباﻹضافة إلى ذلك، أبرزت العديد من الدراسات على أهمية دراسة الأكسدة باستخدام هذا الكائن الحي19،،من2021. لها دورة حياة قصيرة، والقدرة على الجينات ضربة قاضية للفائدة من [رني]، واستخدام البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)-تنصهر الصحفيين لرصد الجينات هي بعض من السمات التي تجعل من نظام نموذج جذاب. الأهم من ذلك، هي الغاية حفظت المسارات التي تنظم الأكسدة والحصانة الفطرية في الدودة مع الثدييات20،22.
في هذا البروتوكول، فإنه يظهر كيفية استخدام C. ايليجانس لتوضيح الحالة المرضية التي تحدثها الناجم عن العقدية مستمدة ح2س2. يرد مقايسة تعديل البقاء على قيد الحياة، وأعضاء فريق ميتس قادرة على قتل الديدان سرعة عن طريق إنتاج ح2س2. استخدام أعضاء المجموعة ميتس، مصدرا البيولوجي مستدام للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) يتم توفيرها، بدلاً من مصادر المواد الكيميائية التي تسبب الأكسدة في الديدان. وعلاوة على ذلك، البكتيريا قادرة على استعمار الديدان سريعاً، مما يسمح لح2س2 مستهدفين مباشرة إلى الخلايا المعوية (بالمقارنة مع مصادر أخرى لعبور حواجز عدة). تم التحقق من صحته المقايسة أما 1) عن طريق تحديد بقاء سلالة متحولة skn-1 أو 2) التي هدمت skn-1 استخدام [رني] في الديدان بالنسبة إلى N2 البرية من نوع وناقلات مراقبة علاج الديدان. SKN-1 عامل نسخ هامة التي تنظم استجابة الأكسدة في C. ايليجانس23،،من2425. بالإضافة إلى فحوصات البقاء على قيد الحياة، يستخدم لمراقبة تفعيل الأكسدة الاستجابة عن طريق إنتاج ح2س2 سلالة دودة معربا عن مراسل المعدلة وراثيا SKN-1B/C::GFP فريق ميتس.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام الأساليب الموصوفة للبكتيريا المسببة للأمراض الأخرى مثل فايسيوم البرازية، التي تنتج أيضا ح2س2 نمت تحت اللاهوائية أو شروط ميكروايروفيليك26. عادة، للكائنات المسببة للأمراض الأكثر، يستغرق عدة أيام إلى أسابيع لإتمام فحوصات البقاء على قيد الحياة. ومع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور يان بينغ وانغ، الدكتورة جينا الجزيء (جامعة تكساس، مدرسة طب الأسنان)، الدكتور ريتشارد لامونت (جامعة لويزفيل، مدرسة طب الأسنان)، والدكتور صموئيل بيتي (مركز السرطان MD أندرسون) لتوفير المختبرات وسلالات السريرية العقديّات المجموعة ميتس. ونشكر أيضا الدكتور كيث بلاكويل (قسم علم الوراثة، مدرسة هارفارد الطبية) لسلالات C. ايليجانس . أخيرا، نحن نشكر الدكتور دانييل جارسين ولها مختبر (جامعة تكساس، كلية الطب ماكجفرن) لتوفير الكواشف وسلالات الفيروس المتنقل لإجراء الدراسة. وقدمت بعض سلالات دودة كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة “برامج الهياكل الأساسية للبحوث” (P40 OD010440).
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned–microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
