Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA
Summary
Questa carta presenta un metodo chirurgico per la dissezione della drosofila retine pupale insieme a protocolli per il trattamento del tessuto per esame immuno-istochimico, analisi occidentale ed estrazione di RNA.
Abstract
La Drosophila pupal retina fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici durante lo sviluppo. In questa carta, presentiamo un protocollo affidabile per la dissezione della drosofila delicato pupal retina. Il nostro approccio chirurgico utilizza strumenti di microdissection prontamente disponibili per aprire pupe ed estrarre con precisione complessi di occhio-cervello. Possono essere fissi, sottoposto ad esame immuno-istochimico e retine poi montate su vetrini da microscopio e ripreso se l’obiettivo è quello di rilevare strutture cellulari o subcellulari. In alternativa, retine unfixed possono essere isolate dal tessuto di cervello, lisate in buffer appropriato e utilizzate per l’estrazione proteica gel elettroforesi o mRNA (valutare espressione della proteina o del gene, rispettivamente). Pazienza e pratica significativa potrebbe essere necessario padroneggiare il protocollo di microdissection descritto, ma una volta imparato, il protocollo consente relativamente rapido isolamento delle retine principalmente intatta.
Introduction
La retina di Drosophila è composta da circa 750 ommatidi circondati da cellule del pigmento, disposti in un nido d’ape della grata1,2,3,4. Ogni ommatidium contiene otto neuroni del fotoricettore, quattro lente-secrezione delle cellule cono e due cellule del pigmento primarie. Che circonda ogni ommatidium è cellule produttrici di pigmento di grata e gruppi di setole sensoriali. Grazie alla sua natura post-mitotico e stereotipata disposizione esagonale, retina pupal Drosophila fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici compreso cellula adesione5,6, 7,8,9,10 e apoptosi11,12,13,14,15.
Diversi protocolli pubblicati utilizzano aria pressione per estrarre complessi di occhio-cervello da Drosophila pupe16,17,18. Il protocollo descritto qui invece utilizza strumenti di microdissection per attentamente e precisamente isolare complessi di occhio-cervello con l’obiettivo di ottenere tessuto retinico intatto. Questo è fondamentale se le retine sono da utilizzare per morfologica, proteina, o espressione genica analizza quanto stress cellulare o la morte, che potrebbe modificare l’espressione di gene o fenotipo cellulare può provocare danni alla retina. Inoltre, dopo la pratica, da 6 a 10 complessi di occhio-cervello possono essere isolati in 10-15 min, facilitando l’obiettivo di minimizzare la variabilità nell’età e Stadio di sviluppo del tessuto oculare dissecata.
La fissazione, immunostaining e intero-supporto protocollo descritto di seguito è adatto per la preparazione di Drosophila occhi per microscopia fluorescente. Retine possono essere incubate con anticorpi targeting per le proteine di interesse. Ad esempio, gli anticorpi ai componenti di giunzione dei adherens possono essere utilizzati per visualizzare le circonferenze apicale delle cellule, in modo che caratteristiche tra cui il tipo delle cellule, forma e disposizione possono essere valutati19. Prima della fissazione, gli occhi possono essere spaccati invece dal cervello allo scopo di estrarre la proteina per analisi occidentale, o RNA per l’uso in qRT-PCR o RNA-sequenziamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di dissezione di pupal occhio della drosofila qui descritto consente per l’isolamento dei complessi di occhio-cervello di 6 a 10 entro 10-15 min. Tuttavia, pratica e pazienza sono essenziali al fine di padroneggiare la tecnica di dissezione e migliorare la qualità e la velocità delle dissezioni. Questa volta breve dissezione assicura che ogni occhio è circa lo stesso stadio di sviluppo, riducendo la variabilità nell’espressione di gene o fenotipo delle retine in un set di dati. Mentre protocolli al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Zack tamburo e nostri recensori per utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da R15GM114729.
Materials
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
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