ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

1. SC 抽出 EDTA を水に溶解させることによって 100 mL の抽出バッファー (表 2を参照) を準備します。完全に溶解するまで KOH で pH を上げ、HCl で pH を7.5 に調整します。溶液に残りの成分を追加し、水で最終的なボリュームに完了し、氷の上に保ちます。チューブでは、抽出バッファーに digitonin を溶解させ、10% の原液を作り、完全に溶解するまで徹底的に渦をかけ、氷上で維持します。注: 抽出バッファは、事前に調製し、最大2ヶ月の4° c に保つことができます。波状バンドがゲルの下部に現れ始めた場合、抽出バッファーが古すぎることを意味します。10% digitonin 溶液を調製するときは、マウスの肝臓のミトコンドリアを使用している場合、サンプルあたりのストックボリュームカウント500μ l を準備します。Digitonin 溶解度は、起源および製品ロットによって異なります (資料の表を参照してください)。 動物組織から単離されたミトコンドリア (マウス心臓、筋肉、肝臓、ラット心臓) または細胞 (ヒト線維芽線) を用いて標準プロトコール23、24、25を使用して、SCs の抽出を行うことができる。ミトコンドリアが得られたら、メーカーの推奨に従って bicinchoninic 酸測定キットを使用してタンパク質含量を定量化します。必要に応じて、このステップでプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を用いた単離されたミトコンドリアを補う。注: SCs は、新鮮または解凍されたミトコンドリアのいずれかで抽出することができます。すべてのサンプルから SCs を同時に抽出し、同じ条件下で同じ溶液バッチで処理されることを保証することをお勧めします。 得られたミトコンドリアタンパク質濃度に基づいて、最終的な digitonin/タンパク質比を所望し、表 1に従って必要とされるストック digitonin 溶液および抽出バッファーの体積を計算する。SC 抽出のために、ミトコンドリアタンパク質の10μ g ごとに digitonin を含む1μ l の抽出バッファー (表 2) を加えます。Digitonin/タンパク質比は、2から 8 g/g に変化することができます。Digitonin 滴定は、使用するサンプルの新しいタイプごとに常に実行する必要があります (例については図 2を参照)。 ペレットのミトコンドリアは、1.5 mL チューブで、16000 x gで4° c で10分間遠心分離した。 その上清を廃棄し、digitonin を含む氷冷抽出バッファーの計算量でミトコンドリアペレットを再懸濁させる。ミニチューブ回転子にチューブを配置し、中回転速度で4° c で30分間インキュベートします。サンプルが適切に混合されていることを確認します。 20400 x gのサンプルを4° c で45分間遠心分離し、insolubilized の断片を除去します。 氷の新しい管に上澄みを移し、タンパク質を定量化します。この画分は、呼吸 supercomplexes 抽出物を表す。同じ日に電気泳動が行われない場合は、-80 ° c でサンプルを保管してください。注: 1) 必要であれば、最初の凍結/解凍サイクルの前に、これがアリコートサンプルのより高い分子配列を破壊するので、抽出の凍結/解凍サイクルを避けてください。2) 標準的な BN-ページ実験を実行するには、この手順で SCs 抽出に CB を追加する必要があります。CB は、使用される洗剤の量に対して 1g/8g 比で添加されるべきである。 2. 勾配のゲルの鋳造および電気泳動 勾配ゲル、アリコート、および-20 ° c での保管には、3倍勾配バッファーとアクリルアミドストックを用意してください (表 3を参照)。 アノードおよびカソードバッファーを準備し、4° c で保管してください (表 5を参照)。 鋳造室を開け、外側のガラスプレート (20cm x 22 cm) をチャンバーに置きます。アライメント・カードを使用してスペーサー (1.5 mm) を1セット配置し、チャンバの側面と角にしっかりと固定されていることを確認します。内側のガラス板 (20 cm x 20cm) をスペーサーの上に置き (ゲルサンドイッチを形成)、プラスチックの分離シートをガラス板の上に置きます。 必要な数のゲルがキャストするまでステップ2.3 を繰り返します。このプロトコルでは、4つのゲルがキャストされます。私達が使用する鋳造の部屋システム (材料のテーブルを見なさい) は一度に10のゲルの最高の鋳造を可能にする。最初に必要に応じて、できるだけ多くのアクリルブロックを追加することにより、チャンバー内の残りのスペースを取り、その後、必要に応じてガラス板。注: モンタージュはしっかりと密閉されている必要があります。室内にゲルサンドイッチの間にはスペースを入れるべきではありません。 ガスケットをガスケットのノッチにしっかりと固定する前に、溝にパラフィルムのストリップを置きます。密閉プレートをチャンバーに置き、6本のネジをすべて締めます。鋳造室に立つ。 「光」混合チャンバ内の磁気攪拌機で攪拌プレート上に元勾配を配置します。鋳造室のチューブを勾配前者に接続し、蠕動ポンプのカセットにチューブを固定し、勾配前者の活栓が閉じていることを確認します。 4ゲルを鋳造するために、三角フラスコに 4% および 60 mL の 12% ゲル溶液 (表 4を参照) の 60 ml を調製し、混合するために徹底的に旋回する。60 mL の 4% ゲル溶液を「光」混合チャンバに注ぎ、勾配前者の「重」貯留チャンバ内に 12% の 60 mL を注ぐ。攪拌板の撹拌速度を 350 rpm で設定します。活栓を開き、35 rpm でポンプをオンにします。 光の割合が重い分画よりも低い場合は、ポンプを一時停止し、「光」と「重い」貯水池の間にバルブステムを開き、フラクションボリュームを平衡化にして、ポンプを再起動します。注: 泡がシステムに入らないし、ガラス板の間に閉じ込められることが重要です。この問題が発生した場合は、モンタージュ、ウォッシュ、やり直しを元に戻します。 勾配ゲルが完全に注がれると、ポンプを停止し、ゲルの乾燥を防ぐために水 (約 1ml) を各ゲルサンドイッチに重ねます。2時間重合ましょう。 三角に 25 mL の積み重ねのゲルを準備し、徹底的に混ぜるために旋回しなさい。水を除去し、各ゲルサンドイッチに15ウェル櫛を挿入します。積み重ねのゲルを注ぎ、2 h のための重合をしなさい。注: ゲルは1週間、4° c で鋳造して保持することができます。 サンドイッチクランプにゲルを挿入し、櫛を削除します。短いガラス板を下に向けて、冷却コアにゲルサンドイッチを挿入します。反対側で繰り返し、電気泳動タンクにコアを置きます。 電気泳動タンクの内部チャンバに 300 mL の青色カソード緩衝液を注ぎます。電気泳動タンクの外室に陽極緩衝液を 2 L 注ぎます。注: 電極をカソードバッファーに沈めて、約 300 mL を必要とします。 1ウェルあたりのタンパク質の75μ g と175μ g の間で負荷をかけます。1.5 h のために 150 V でゲルを実行してください (またはサンプルが全て勾配ゲルに入るまで) 冷蔵室 (4 ° c) で。注 1: 1) ゲル内活性バンドの良好な分解能には、ウェルあたり最低75μ g が必要です。タンパク質の175μ g 以上をロードすると、酵素活性が過剰になるためにクリアバンドが失われます。2) サンプルの反復は、ゲル内活性の並列決定および OXPHOS 複合体のイムノブロット分析を可能にするために、別々のウェルに装填する必要があります。CI、CII、CIV、および CV に対する IGA の並列決定には、最低300μ g が必要です。 CI、CII、CII、CIV、および CV の並列イムノブロット分析には、最低375μ g が必要です。 Pipet または真空で青色の陰極緩衝液を除去し、300 mL のクマシーブルーフリーのカソードバッファーに交換し、冷蔵室 (4 ° c) で一晩 (16 〜20時間) の 200 V でゲルを実行します。ゲル内活性測定またはイムノブロッティングアッセイの手順3または4に進みます。 3. 複合体 I、II、IV および CV のゲル内活性 電気泳動の終了前に、表 6に従ってゲル内活性バッファーを準備し、RT で暗所に保管してください。 20 mL のゲル内活性バッファーは、3つのサンプルレーンに十分です。注: この CV in ゲル活性アッセイは、ATPsynthase (すなわち、ATP 加水分解) の逆活性に基づいており、カルシウムを副因子として使用し、ゲル中で沈殿します。カルシウムは他のプロトコルで使用される鉛よりも害が少ない。さらに、このプロトコルの使用は、ゲル23の事前活性化/コンディショニングを必要としない。 電気泳動を止め、ゲルを取り出します。必要に応じてレーンをカットし、ジェルレーンをビニール袋 (3 面カット、本のように開いたビニール袋) に移します。ヒートシーラーで3側面のシール2。注: 実験グループ間で SC バンドの組成を比較するには、同じサンプルを同じゲル上の反復で実行することをお勧めします。レーンを切り、異なるゲル内活性バッファー (CI、II、IV、V) で各反復をインキュベートします。アッセイの特異性を確認するために、追加の反復を、特定の呼吸鎖阻害剤の存在下でゲル活性において実行するために調製することができる。 3つの実験試料 (すなわち3ウェル) について、20 mL のゲル内活性緩衝液を加え、気泡を除去し、ビニール袋の 4番目の側面を密封する。注: 実行された場合、陰性対照実験に阻害剤を加える: CI: ロテノン1μ m;CII: Malonate ナトリウム 10 mM;CIII: Antimycin-8 μ m;CIV: KCN 0.6 mM;CV: Oligomycin 0.5 μ m。 暗闇の中でゲルレーンを37° c でインキュベートし、15分ごとにチェックします。インキュベーション時間は、タンパク質および複合体の量によって異なります。CI は CIV または CV よりも速く反応します。最適な染色は通常、CI の場合は2時間後、CIV の場合は4時間、CII と CV の場合は 6 h に発生します。 水の中でゲルレーンをすすぎ、反応を停止させると、CV の CI、CII、CIV、または黒の背景の白い背景に画像を表示します。注: ゲルは、数ヶ月間、RT または4° c でビニール袋に保管することができます。 4. イムノブロッティングアッセイ 表 7に従って転送バッファを準備し、rt で保持する。 TBST を準備し、rt で維持します。 ゲル全体または選択したレーンを容器に入れ、SDS (転送バッファで 0.25% のファイナル) を添加して転送バッファを追加します。ロッカーにコンテナを置き、1時間インキュベートします。 PVDF メンブレン (ゲルのサイズに対応するサイズ) をカットし、撹拌下で 20 mL のメタノールを2分間攪拌し、20 mL の転写バッファーに置き換え、撹拌下に2分間入れます。 転写サンドイッチを下から上に準備し、ジェルとアクティブな PVDF メンブレンの間に気泡がないことを確認します: カセット/ブラックスポンジ/ブロッティング紙/メンブレン/ジェル/ブロッティング紙/黒スポンジ/ブラックサイドカセットのクリアサイド。カセットを閉じてロックします。 転送タンクに移動サンドイッチを置き、電極の赤色側に面するサンドイッチのクリアサイドで、ゲルを immerge するために転写バッファを注ぎます。冷却システムをトランスファータンクに接続し、4° c に設定します。電源に接続し、40 mA で設定し、24時間実行します。 膜を取り出し、TBST の 5% BSA で1時間ブロックし、4° c で一晩 TBST で 5% BSA で調製した一次抗体溶液にインキュベートします。注: 使用する抗体については表 8を参照してください。 TBST 3 倍の膜をそれぞれ10分間洗浄する。 TBST の 5% BSA で調製した二次抗体溶液中の膜を、室温で2時間インキュベートします。 TBST 3 倍の膜をそれぞれ10分間洗浄する。 膜およびイメージに化学発光の解決を加えなさい。 5. 分析 ゲル内活性アッセイ画像または immunoblots を使用して、SCs を分析することができます。バンドの合成を分析し、反復を調整し、与えられたバンドごとにどの複合体が正に反応したかを検証します。 さまざまな超分子アセンブリで、複合体の分布を解析するには、ImageJ で画像を開き、ゲル分析ツールを使用します (例については図 5を参照してください)。 矩形ツールで車線を選択し、車線をプロットします。 線を描画して、目的の各バンドの曲線の下の領域を閉じ、[杖] ツールを使用して各領域をクリックすると、曲線の値の下の領域を含むテーブルが生成されます。 複合体の分布を計算するには、各バンドの値をモノマーの相対的な基準に基づいてレポートします。