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Biochemistry

Électrophorèse hybride Clear/Blue native pour la séparation et l’analyse des supercomplexes de la chaîne respiratoire mitochondriale

Published: May 19, 2019
doi:
10.3791/59294
,
1Interdisciplinary School of Health Science, Faculty of Health Sciences and Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Medicine,University of Ottawa

Summary

Nous présentons ici un protocole pour extraire, résoudre et identifier les supercomplexes mitochondriaux qui minimisent l’exposition aux détergents et au bleu de Coomassie. Ce protocole offre un équilibre optimal entre la résolution et la préservation des activités enzymatiques, tout en minimisant le risque de perte des interactions protéine-protéine labiles.

Abstract

Les complexes des machines de phosphorylation oxydative forment des arrangements protéiques supramoléculaires nommés supercomplexes (SCs), qui sont censés conférer des avantages structurels et fonctionnels aux mitochondries. Les SCs ont été identifiés dans de nombreuses espèces, de la levure au mammifère, et un nombre croissant d’études signalent la perturbation de leur organisation dans les maladies humaines génétiques et acquises. En conséquence, un nombre croissant de laboratoires sont intéressés à analyser les SCs, ce qui peut être difficile sur le plan méthodologique. Cet article présente un protocole optimisé qui combine les avantages des méthodes Blue-et Clear-Native PAGE pour résoudre et analyser les SCs de manière efficace dans le temps. Avec cette méthode hybride CN/BN-PAGE, les SCs mitochondriales extraites avec des quantités optimales de la digitonine de détergent doux sont exposées brièvement au colorant anionique Coomassie Blue (CB) au début de l’électrophorèse, sans exposition à d’autres détergents. Cette courte exposition au CB permet de séparer et de résoudre les SCs aussi efficacement qu’avec les méthodes traditionnelles BN-PAGE, tout en évitant l’impact négatif des niveaux élevés de CB sur les essais d’activité in-gel, et les interactions labiles protéine-protéine au sein de SCs. Avec ce protocole, il est donc possible de combiner des mesures précises et rapides de l’activité de gel avec des techniques analytiques impliquant l’électrophorèse 2D, l’immuno-détection et/ou la protéomique pour l’analyse avancée des SCs.

Introduction

Les mitochondrie produisent de l’énergie par phosphorylation oxydative, où les complexes respiratoires I-II-III-IV oxydent les substrats et transfèrent les électrons à l’oxygène, générant un gradient qui permet la phosphorylation de l’ADP par l’ATP synthase (CV). Au cours des dernières années, des études approfondies ont montré que les complexes de la chaîne respiratoire ne sont pas uniquement incorporés de façon linéaire dans la membrane mitochondriale interne, mais sont également organisés en arrangements de supercomplexes (SCS)1,2. Dans les mitochondries de mammifères, les SCs existent dans des stoechiomètres variés: CI/CIII2/civ1-4 (qui est nommé le respirasome, et qui est capable de NADH: O2 oxydoréduction in vitro)2, ci/CIII2, et CIII2 /CIV1-23,4. En outre, les complexes respiratoires sont distribués sous différents rapports entre leur forme libre et les arrangements SCs. Par conséquent, on estime que 85% – 100% des CI, 55% – 65% du CIII et 15% – 25% des CIV se trouvent dans le SCs4. Ces structures supramoléculaires sont pensées pour diminuer la production de ROS, stabiliser ou aider à l’assemblage de complexes individuels, réguler l’activité de la chaîne respiratoire et prévenir l’agrégation des protéines dans la membrane mitochondriale interne riche en protéines5 ,6,7,8. Leur capacité de remodelage sur la variation de la demande d’énergie et leur importance dans la pathogenèse des maladies est étudiée dans plusieurs laboratoires3,7,9,10, le 11 , le 12 , le 13 , 14. des études ont démontré que les changements pathologiques dans l’assemblage de SCS sont présents dans une variété de troubles, y compris, mais sans s’y limiter, le défaut génétique dans la synthèse de cardiolipine15, insuffisance cardiaque16, ischémie-reperfusion17, diabète12, et vieillissement18.

L’électrophorèse native et l’immunodétection sont largement utilisées dans les études SCS pour résoudre les complexes OxPhos des arrangements quaternaires2,19,20,21. L’électrophorèse native peut être combinée avec des dosages spécifiques de l’activité de gel ou de la page 2D-SDS pour permettre une détermination moléculaire précise des différents assemblages SCS1,19. La capacité d’étude des SCs dépend de façon critique des conditions d’extraction, y compris le type et la concentration de détergent utilisé, la force ionique et le pH, ainsi que sur les conditions de migration électrophorétique, qui comprennent la composition du tampon, la présence de CB, de gel la taille et le pourcentage d’acrylamide2.

Les protocoles et la résolution de bande SCs varient grandement entre les documents, rendant la comparaison entre les études difficile et l’adaptation des méthodes difficiles22. Par conséquent, cet article propose un protocole solide et optimal pour extraire des SCS de mitochondries isolées de différentes sources avec la digitonine non ionique de détergent, et pour résoudre des bandes de SCS de poids moléculaire élevé. La concentration de détergent optimisée, la composition du tampon d’extraction et l’absence de Coomassie Blue dans la préparation de l’échantillon minimisent la perturbation des complexes protéiques. Ce protocole (voir la figure 1 pour une vue d’ensemble) combine CN-page et BN-page pour une résolution des assemblages SCS optimale sur un grand gel, et est compatible avec les tests d’activité in-gel permettant une meilleure visualisation des bandes réactives, ainsi que l’utilisation de immunodétection pour une analyse détaillée des arrangements et de la composition des SCs.

Protocol

1. extraction SC Préparer 100 mL de tampon d’extraction (voir tableau 2) en dissolvant l’EDTA dans l’eau. Augmenter le pH avec KOH jusqu’à dissolution complète, puis ajuster le pH à 7,5 avec HCl. ajouter les composants restants à la solution, terminer au volume final avec de l’eau, et garder sur la glace. Dans un tube, dissoudre la digitonine dans le tampon d’extraction pour faire une solution d’action de 10%, Vortex soigneusement jusqu’à dissolution complète, et garder sur la glace.Remarque: le tampon d’extraction peut être préparé à l’avance et conservé à 4 ° c pendant 2 mois maximum. Si les bandes ondulées commencent à apparaître au fond du gel, cela signifie que le tampon d’extraction est trop vieux. Lors de la préparation de la solution à 10% de digitonine, préparez un volume de stock comptant 500 μL par échantillon si vous utilisez des mitochondrias hépatiques de souris. La solubilité dans la digitonine varie selon la provenance et le lot de produits (voir tableau des matériaux). Les mitochondries isolées du tissu animal (coeur de souris, muscle, foie; coeur de rat) ou cellules (fibroblastes humains) utilisant des protocoles standard23,24,25 peuvent être utilisées pour l’extraction de SCS. Une fois les mitochondries obtenues, quantifier la teneur en protéines à l’aide du kit de dosage de l’acide bicinchoninique selon les recommandations du fabricant. Supplément mitochondries isolée avec des protéases et des inhibiteurs de phosphatases à cette étape si nécessaire.Remarque: les SCs peuvent être extraites sur des mitochondrias fraîches ou décongelés. Il est recommandé d’extraire les SCs de tous les échantillons en même temps, pour s’assurer qu’ils sont traités avec les mêmes lots de solutions et dans les mêmes conditions. En se basant sur la concentration de protéine mitochondriale obtenue, et le rapport final de digitonine/protéine désiré, calculez le volume de la solution de digitonine de stock et le tampon d’extraction exigés selon le tableau 1. Pour l’extraction de SC, ajouter 1 μL de tampon d’extraction (tableau 2) contenant de la digitonine pour chaque 10 μg de protéine mitochondriale. Le rapport digitonin/protein peut varier de 2 à 8 g/g. Une titration de digitonine doit toujours être effectuée pour chaque nouveau type d’échantillon utilisé (voir la figure 2 pour un exemple). Mitochondria à pellets, dans un tube de 1,5 mL par centrifugation à 16 000 x g pendant 10 min à 4 ° c. Jetez le surnageant et résuspendez le culot mitochondrial dans le volume calculé de tampon d’extraction de glace contenant de la digitonine. Placer les tubes sur un rotateur à mini-tube et incuber pendant 30 min à 4 ° c à une vitesse de rotation moyenne. Assurez-vous que les échantillons se mélangent correctement. Centrifuger les échantillons à 20 400 x g pour 45 min à 4 ° c pour éliminer les fragments insolubilisés. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sur la glace et quantifier les protéines. Cette fraction représente l’extrait des supercomplexes respiratoires. Si l’électrophorèse n’est pas effectuée le même jour, entreposer les échantillons à-80 ° c.NOTE: 1) Évitez les cycles de gel/dégel de l’extrait, car cela perturbe les arrangements moléculaires plus élevés de SCs. aliquot échantillon avant le premier cycle de gel/dégel si nécessaire. 2) pour effectuer une expérience BN-PAGE standard, CB doit être ajouté à l’extrait SCs à cette étape. La CB doit être ajoutée dans un rapport 1g/8g par rapport à la quantité de détergent utilisée. 2. gel de gradient coulée et électrophorèse Préparez 3x tampons de gradient et des stocks d’acrylamide pour faire le gel de gradient, aliquot, et stocker à-20 ° c (voir le tableau 3). Préparez les tampons d’anode et de cathode et conservez-les à 4 ° c (voir tableau 5). Ouvrir la chambre de coulée et placer une plaque de verre extérieure (20 cm x 22 cm) dans la chambre. Positionner un ensemble d’entretoises (1,5 mm) à l’aide de la carte d’alignement pour s’assurer qu’elles sont fermement assises contre les côtés et les coins de la chambre. Placer une plaque de verre intérieure (20 cm x 20 cm) sur le dessus des entretoises (ce qui forme le sandwich au gel), et mettre une feuille de séparation en plastique sur le dessus de la plaque de verre. Répétez l’étape 2,3 jusqu’à ce que le nombre désiré de gels à lancer soit atteint. Pour ce protocole, 4 gels sont castés. Le système de chambre de coulée que nous utilisons (voir tableau des matériaux) permet la coulée d’un maximum de 10 gels à la fois. Prenez l’espace restant dans la chambre en ajoutant d’abord autant de blocs acryliques que nécessaire, puis des plaques de verre si nécessaire.Remarque: le montage doit être hermétiquement scellé; il ne devrait pas y avoir de place entre les sandwiches au gel dans la chambre. Placez une bande de Parafilm dans la rainure avant d’asseoir le joint fermement dans l’encoche du joint. Placez la plaque d’étanchéité sur la chambre et serrez les 6 vis. Tenez la chambre de coulée. Placer l’ancien gradient sur une plaque d’agitation avec un agitateur magnétique dans la chambre de mélange «lumière». Raccordez la tubulure de la chambre de coulée au gradient antérieur, fixez le tube dans la cassette de la pompe péristaltique et assurez-vous que le robinet de l’ancien gradient est fermé. Pour lancer 4 gels, préparer 60 mL de 4% et 60 mL de solution de gel à 12% (voir tableau 4) dans une fiole d’erlenmeyer et agiter soigneusement pour mélanger. Verser 60 mL de solution de gel à 4% dans la chambre de mélange «légère» et 60 mL de 12% dans la chambre du réservoir «lourde» du gradient antérieur. Régler la vitesse d’agitation de la plaque à 350 tr/min. Ouvrez le robinet et allumez la pompe à 35 tr/min. Une fois que la fraction lumineuse est inférieure à la fraction lourde, mettre la pompe en pause et ouvrir la tige de soupape entre les réservoirs «légers» et «lourds», laisser le volume des fractions équilibré et redémarrer la pompe.Remarque: il est important qu’aucune bulle ne pénètre dans le système et ne se coince entre les plaques de verre. Si cela se produit, annulez le montage, lavez et recommencez. Une fois que le gel de gradient est complètement versé, arrêtez la pompe, et l’eau de recouvrement (environ 1 mL) sur chaque sandwich de gel pour empêcher le séchage du gel. Laisser polymériser pendant 2 h. Préparer le gel d’empilage de 25 mL dans erlenmeyer et agiter pour mélanger soigneusement. Enlevez l’eau et insérez 15 peignes de puits dans chaque sandwich de gel. Versez le gel d’empilage et laissez Polymérisez pendant 2 h.Remarque: les gels peuvent être castés et conservés à 4 ° c pendant 1 semaine. Insérez le gel dans les colliers sandwich et enlevez le peigne. Avec la petite plaque de verre orientée vers le bas, insérez le gel sandwich dans le noyau de refroidissement. Répéter de l’autre côté et placer le noyau dans le réservoir d’électrophorèse. Verser 300 mL de tampon de cathode bleue dans la chambre interne du réservoir d’électrophorèse. Versez 2 L de tampon d’anode dans la chambre externe du réservoir d’électrophorèse.Remarque: l’électrode doit être immergée dans un tampon cathodique, ce qui nécessite environ 300 mL. Charge entre 75 μg et 175 μg de protéine par puits. Exécuter le gel à 150 V pour 1,5 h (ou jusqu’à ce que les échantillons soient tous entrés dans le gel dégradé) dans la chambre froide (4 ° c).NOTE 1:1) un minimum de 75 μg par puits est nécessaire pour une bonne résolution des bandes d’activité in-gel. Le chargement de plus de 175 μg de protéine entraînera une perte de bandes claires en raison d’une activité enzymatique excessive. 2) les répliques de l’échantillon doivent être chargées dans des puits distincts pour permettre la détermination parallèle des activités in-gel et de l’analyse par immunoblot des complexes OXPHOS. La détermination parallèle de l’IGA pour CI, CII, CIV et CV nécessite un minimum de 300 μg. l’analyse d’immunoblot parallèle de CI, CII, CII, CIV et CV nécessite un minimum de 375 μg. Enlevez le tampon de cathode bleue avec le pipettage ou le vide, remplacez par 300 mL de tampon cathodique Coomassie bleu-libre, et courez le gel à 200 V pendant la nuit (16 – 20 h) dans la chambre froide (4 ° c). Passez à l’étape 3 ou 4 pour la mesure de l’activité in-gel ou l’immunoblotting. 3. activité en gel pour les complexes I, II, IV et CV Avant la fin de l’électrophorèse, préparez les tampons d’activité en gel selon le tableau 6et conservez dans l’obscurité à RT. 20 ml de tampon d’activité en gel suffisent pour 3 voies d’échantillonnage.Remarque: ce test d’activité en gel de CV est basé sur l’activité inverse de l’ATPsynthase (c.-à-d. l’hydrolyse de l’ATP), et utilise le calcium comme co-facteur, qui se précipite dans le gel. Le calcium est moins nocif que le plomb utilisé dans d’autres protocoles. En outre, l’utilisation de ce protocole ne nécessite pas de pré-activation/conditionnement du gel23. Arrêtez l’électrophorèse et récupérez le gel. Coupez les voies, si nécessaire, et transférez les voies de gel dans les sacs en plastique (3 côtés coupés, et le sac en plastique ouvert comme un livre). Sceller 2 des 3 côtés avec un scellant thermique.Remarque: pour comparer la composition des bandes SC entre les groupes expérimentaux, il est recommandé d’exécuter les mêmes échantillons dans les répétitions sur le même gel. Coupez les voies pour incuber chaque réplique dans différents tampons d’activité in-gel (CI, II, IV, V). Pour confirmer la spécificité des dosages, des réplicats supplémentaires peuvent être préparés pour fonctionner dans des activités de gel en présence d’inhibiteurs spécifiques de la chaîne respiratoire. Pour 3 échantillons expérimentaux (c.-à-d. 3 puits), ajouter 20 mL de tampon d’activité en gel, enlever les bulles et sceller le 4ème côté du sachet en plastique.NOTE: ajouter des inhibiteurs dans les expériences de contrôle négatif si effectué: CI: rotenone 1 μM; CII: malonate de sodium 10 mM; CIII: antimycine-A 8 μM; CIV: KCN 0,6 mM; CV: oligomycine 0,5 μM. Incuber les voies de gel à 37 ° c dans l’obscurité et vérifier toutes les 15 min. le temps d’incubation varie en fonction de la quantité de protéines et de complexes. CI réagira plus rapidement que CIV ou CV. la coloration optimale se produit généralement après 2 h pour CI, 4 h pour CIV et 6 h pour CII et CV. Rincez les voies de gel dans l’eau pour arrêter la réaction, et l’image sur un fond blanc pour CI, CII, CIV, ou fond noir pour le CV.Remarque: les gels peuvent être conservés dans des sachets plastiques à RT ou à 4 ° c pendant plusieurs mois. 4. immunoblotting Préparez le tampon de transfert selon le tableau 7et conservez-le à RT. Préparez la TBST et conservez-la à RT. Placez le gel entier, ou les voies sélectionnées, dans un récipient et ajoutez le tampon de transfert complété avec SDS (0,25% final dans le tampon de transfert). Placer le récipient sur le rocker et incuber pendant 1 h. Coupez la membrane PVDF (taille correspondant à la taille du gel) et activez dans 20 mL de méthanol sous agitation pendant 2 min. Remplacez par 20 mL de tampon de transfert et placez-le sous agitation pendant 2 min. Préparez le sandwich de transfert, de bas en haut, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulle entre le gel et la membrane PVDF activée: côté clair de la cassette/éponge noire/papier buvard/membrane/gel/papier buvard/éponge noire/côté noir de la cassette. Fermez et verrouillez la cassette. Placez le sandwich de transfert dans le réservoir de transfert, avec le côté clair du sandwich faisant face au côté rouge de l’électrode, et versez le tampon de transfert pour plonger le gel. Raccorder le système de refroidissement au réservoir de transfert et régler à 4 ° c. Raccorder à l’alimentation, régler à 40 mA, et exécuter pendant 24 h. Récupérer les membranes, bloquer pendant 1 h dans 5% de BSA dans la TBST, et incuber dans la solution primaire d’anticorps préparée dans 5% de BSA dans la TBST pendant la nuit à 4 ° c.Remarque: Voir le tableau 8 pour les anticorps utilisés. Rincer les membranes en TBST 3x pendant 10 min chacune. Incuber les membranes dans des solutions d’anticorps secondaires préparées dans 5% de BSA en TBST pendant 2 h à température ambiante. Rincer les membranes en TBST 3x pendant 10 min chacune. Ajouter une solution chimiluminescente aux membranes et à l’image. 5. analyse des Les images d’analyse d’activité in-gel ou les immunotransferts peuvent être utilisés pour analyser les SCS. Pour analyser la composition des bandes, alignez les réplicats et validez le complexe qui réagit positivement pour chaque bande donnée. Pour analyser la distribution des complexes, dans divers assemblages supramoléculaires, ouvrez des images dans ImageJ et utilisez l’outil d’analyse de gel (voir la figure 5 pour un exemple). Sélectionnez les voies avec l’outil Rectangle et les tracés de tracé. Dessinez des lignes pour fermer la zone sous la courbe de chaque bande d’intérêt et cliquez sur chaque zone avec l’outil baguette pour générer une table contenant la zone sous les valeurs de courbe. Pour calculer la distribution du complexe, signalez les valeurs de chaque bande par rapport à celle du monomère.

Representative Results

La figure 2 montre les résultats d’une expérience de titrage de digitonine visant à identifier la quantité appropriée de digitonine requise pour l’extraction des SCS. Ce montant variera selon le type de tissu/cellule et indique si l’échantillon a été congelé ou non. Pour cette expérience, une activité de CIV in-gel a été réalisée pour visualiser les SCs isolées des mitochondria fraîches de foie de souris. Des rapports de 2/1 à 10/1 g de digitonine/g de protéine ont été testés. La quantité optimale de digitonine pour cet échantillon est de 4 g/g, car elle fournit une bonne résolution de CIV monomérique, et de SCs de poids moléculaire élevé. À un ratio inférieur, les bandes ne sont pas claires et se résolvent dans un frottis pendant l’électrophorèse, alors que l’utilisation d’un ratio plus élevé de digitonine conduit à une perturbation du SC de poids moléculaire élevé. La figure 3 et la figure 4 montrent les résultats d’une expérience complète réalisée sur une préparation de mitochondries hépatique de souris extraite avec 4 g de digitonine/g de protéine. Les protéines ont été séparées en utilisant l’hybride BN/CN-PAGE, la norme BN-PAGE, ou CN-PAGE. Les trois gels ont été castés en même temps et les voies ont été chargées avec des répliques du même échantillon. Après l’électrophorèse, les voies individuelles ont été coupées et traitées pour la mesure de l’activité du gel (ci, CII, CIV et CV sur la figure 3) et l’immunobuvardage (ci, CII, CIII, CIV, CV sur la figure 4). L’addition de CB soit momentanément dans un tampon cathodique (c.-à-d. hybride CN/BN-PAGE), soit dans un tampon d’échantillonnage et de cathode tout au long de l’électrophorèse (c.-à-d. BN-PAGE), améliore considérablement la mobilité et la résolution des bandes SC et des complexes respiratoires individuels par rapport à CN-PAGE (figure 3). Les bandes sont facilement distinguables avec la technique hybride ou BN-PAGE après l’activité in-gel pour CIV, alors que dans le même échantillon résolu par CN-PAGE, SCs et les bandes réactives monomères CIV ne peuvent pas être identifiés. La figure 3 et la figure 4 montrent que la résolution et le profil des bandes des monomères et des assemblages supramoléculaires d’OxPhos sont qualitativement comparables entre les hybrides CN/BN-PAGE et BN-page. Cependant, il existe des différences notables. Premièrement, la mobilité électrophorétique des complexes OXPHOS est légèrement réduite lorsque les protéines sont séparées en utilisant des conditions hybrides CN/BN-PAGE vs standard BN-page, en raison de la quantité réduite de CB. Ce changement de mobilité est plus important pour les monomères CIV, suivis des monomères CV et CI (figure 3 et figure 4). Deuxièmement, le fond bleu est plus bas dans l’hybride CN/BN-PAGE par rapport à BN-PAGE (figure 3, voies de gauche). En conséquence, les niveaux de fond élevés suivant BN-PAGE masquent complètement l’activité in-gel coloration pour CII, et améliore le bruit de fond associé à l’activité des dimères CIV (figure 3). Troisièmement, l’activité du CV est plus élevée lorsque les échantillons sont exécutés sous des conditions hybrides CN/BN-PAGE par rapport à BN-PAGE (figure 3), en raison de la quantité réduite de CB, qui est connue pour interférer avec l’activité catalytique CV. 26 CN/BN-page permet également une meilleure préservation des assemblages supramoléculaires CV, comme le montre une plus grande proportion de l’activité totale de CV associée aux dimères CV (figure 3). En outre, les oligomères CV sont visibles sous CN/BN-PAGE, alors qu’ils sont complètement dissociés dans les conditions BN-PAGE. Il est intéressant de noter que des bandes distinctes montrant l’activité CV sont également observées entre monomères et dimères CV, lorsque les échantillons sont exécutés sous CN/BN-PAGE (figure 2). La figure 5 présente une analyse représentative de la distribution complexe d’OXPHOS dans les assemblages supramoléculaires. L’image montre ci dans l’activité de gel des échantillons obtenus à partir de 4 préparations distinctes de mitochondries de foie de souris saines. L’analyse de la densitométrie permet de mesurer la zone sous la courbe des bandes réactives CI et de présenter la répartition relative de l’activité C1 dans les formes monomères (I1) et supramoléculaires (i1III2, i1III2IV 1, I1III2IVn). Une analyse similaire peut être effectuée après l’immunoblot. Figure 1: workflow de dosage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2: titrage de Digitonin pour extraire des supercomplexes de mitochondria fraîches de foie de souris. Cet exemple montre des aliquotes de mitochondria hépatiques de souris, isolés d’un animal qui a été traité avec des quantités croissantes de digitonine pour extraire les supercomplexes respiratoires. Les échantillons ont ensuite été résolus par la PAGE hybride CN/BN, et l’activité in-gel de CIV a été déterminée. CIV1: monomères du complexe IV; CIV2: dimères complexes IV; SC: supercomplexes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3: activité in-gel des complexes OXPHOS suivant CN/BN-page hybride, BN-page ou CN-page. Les mitochondries hépatiques isolées d’une souris ont été traitées avec la digitonine (4 g/g ratio digotonine/protéine) pour extraire les supercomplexes respiratoires. Les aliquots de cet échantillon ont ensuite été chargés sur plusieurs puits en trois gels distincts et soumis à CN/BN-PAGE, BN-page ou CN-PAGE. Chaque voie de répétition au sein de chaque gel a ensuite été coupée et immédiatement utilisée pour les essais d’activité in-gel (étiquetés CI, CII, CIV et CV). Une voie a été utilisée comme contrôle pour montrer l’arrière-plan (étiqueté BG) coloration avec Coomassie Blue. Les complexes OXPHOS et les assemblages supramoléculaires sont identifiés à l’aide de la nomenclature standard, avec des nombres dans les indices indiquant la stoechiométrie moléculaire de chaque complexe OXPHOS. Il convient de noter que la position des assemblages supramoléculaires contenant du CIII est basée sur l’immunodétection puisque l’activité in-gel de l’ICII n’a pas été réalisée dans cette expérience particulière. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4: analyse par immunoblot des complexes OXPHOS suivant CN/BN-page hybride ou BN-page. Les répliques des expériences décrites dans la légende de la figure 3 ont été transmises par électro-transmission sur une seule membrane. Après le transfert, des voies individuelles ont été coupées et incubées avec des anticorps spécifiques reconnaissant CI, CII, CIII, CIV et CV. les complexes OXPHOS et les assemblages supramoléculaires sont identifiés à l’aide de la nomenclature standard, avec des nombres dans des indices indiquant la stœchiométrie moléculaire de chaque complexe OXPHOS. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5: quantification de la distribution de ci dans les assemblages monomères et supramoléculaires. (A) activité in-gel de ci déterminée à la suite de l’hybride CN/BN-page des extraits de mitochondries SC du foie obtenus à partir de 4 souris. Bdensitogrammes obtenus à l’aide de l’outil d’analyse du gel d’ImageJ montrant des pics distincts correspondant aux monomères ci i1et à divers complexes supramoléculaires contenant des ci i1III2, i1III2IV1 , et I1III2IVn). C) quantification de la répartition relative de l’activité C1. Les données représentent la moyenne et la SEM des 4 souris. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Rapport de digitonine/protéine (g/g) 2 g/g 4 g/g 6 g/g 8 g/g Volume du tampon d’extraction (μL) 400 300 200 100 Volume de 10% d’actions digitonine (μL) 100 200 300 400 Volume total du tampon d’extraction (μL) 500 500 500 500 Tableau 1: volumes requis pour extraire des SCs de 5 mg de protéines mitochondriales à l’aide de divers ratios de digitonine/protéine. enceinte Concentration finale EDTA, pH 7,5 de 1 mM Hepes de 30 mM Acétate de potassium 150 mM Glycérol 12 Acide 6-aminocaproïque de 2 mM Tableau 2: tampon d’extraction SC (concentrations finales). Conserver à 4 ° c pendant un maximum de 3 mois. enceinte Concentration finale 3x tampon gel: Aliquot et conserver à-20 ° c, pH 7,5 Imidazole/HCl pH-7,0 75 mM Acide 6-aminocaproïque 1,5 M Tampon d’acrylamide: Aliquot et conserver à-20 ° c Acrylamide 99,5% Bis-acrylamide 3 Tableau 3: tampons de stock de gel. Pour 2 gels: 4% (60 mL) 12% (60 mL) Empilage (4%) (25 mL) 3X tampon gel 19,8 mL 19,8 mL 8,25 mL Tampon d’acrylamide 4,8 mL 14,4 mL de 2 mL H2O 35 mL 13,1 mL 14,6 mL Glycérol – de 12 mL – APS 10% 360 μL de la 60 μL de la 150 μL de la TEMED 24 μL de 12 μL de 10 μL de Tableau 4: gel à gradient de 4% à 12%. enceinte Concentration finale Tampon d’anode: conserver à 4 ° c, pH 7,5 Imidazole de 25 mM Tampon cathodique: conserver à 4 ° c, pH 7,5 Tricine 50 mM Imidazole 7,5 mM Avec ou sans Coomassie Blue (G250) 0,022% Tableau 5: tampons d’électrophorèse. enceinte Concentration finale Activité complexe I tampon: préparer frais dans 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 Nitrotetrazolium bleu de 3 mM Nadh de 14 mM Complexe II activité tampon: préparer frais dans 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 Succinate de 20 mM PMSF 0,2 mM Nitrotetrazolium bleu de 3 mM Complexe d’activité IV tampon: préparer frais en 50 mM na-phosphate pH 7,2 Cytochrome C 0,05 mM Diaminobenzidine 2,3 mM ATPsynthase tampon d’activité: préparer frais dans l’eau, ajuster le pH à 8 avec KOH Glycine 50 mM MgCl2 de 5 mM Hepes 50 mM La CaCl2 de 30 mM Atp de 5 mM Tableau 6: tampons d’analyse d’activité en gel. enceinte Concentration finale Tampon de transfert Base Tris de 25 mM Glycine 192 mM Sds 4 Méthanol 20 TBST Base Tris de 20 mM Nacl 137 mM Tween 20 0,1% Tableau 7: tampons immunoblotting. complexe Sous-unité cloner Je NDUFA9 20C11B11B11 Ii SDHA 2E3GC12FB2AE2 Iii UQCRC2 13G12AF12BB11 Iv COX4 1D6E1A8 contre ATPB 3D5 Tableau 8: anticorps utilisés pour immunobuvardage pour détecter la chaîne respiratoire SC. Voir le tableau des matériaux pour les entreprises et les numéros de lot.

Discussion

Les supercomplexes mitochondriaux sont activement étudiés pour élucider leur rôle physiologique, et leur importance dans la pathogenèse de nombreuses maladies humaines, qu’elles soient acquises ou que les maladies génétiques mitochondriales3,7 , le 9 , le 10 , le 11 , le 12 , le 13 , 14. afin d’obtenir des résultats fiables, plusieurs aspects doivent être examinés. Ce protocole a été testé avec des mitochondries hépatiques de souris, des mitochondries musculaires de souris squelettiques (résultats non montrés), des mitochondrias cardiaques de rat, et des mitochondries de fibroblastes humains (résultats non montrés), mais pourrait certainement être adapté à d’autres sources d’isolement Mitochondries. La méthode combine de façon optimale divers aspects des protocoles BN et CN-page, ce qui permet de réduire au minimum l’exposition aux détergents et aux composés anioniques par rapport aux protocoles publiés20,27,28.

Préparation de l’échantillon

La préparation des échantillons représente une étape cruciale pour une séparation réussie des SCs. la composition du tampon doit être soigneusement choisie afin d’obtenir une solubilisation correcte des protéines et des assemblages de protéines, tout en préservant autant que possible leur et l’intégrité structurelle. La force ionique et le pH du tampon d’extraction sont deux facteurs importants à considérer. Les concentrations de sel qui sont trop basses (< 50 mM K-acétate ou NaCl) entraînent une mauvaise solubilisation des protéines en présence de détergents non ioniques, alors que les concentrations de sel supérieures à 500 mM favorisent l’empilage/agrégation des protéines et la précipitation des CB et les protéines29. Les SCs doivent donc être extraites à l’aide de tampons à une force ionique quasi physiologique. En ce qui concerne le pH, l’utilisation d’un pH proche physiologique est recommandée.

Le type de détergent et le rapport détergent/protéine sont également essentiels pour une extraction SC optimale. Pour la préservation maximale des SCs indigènes, la digitonine est préférée à26. Comme le montre le présent protocole et d’autres méthodes publiées23,30,31,32, ce détergent doux préserve la composition supramoléculaire de plusieurs assemblages SC, et le dimère et la structure oligomérique de l’ATPsynthase (figure 3 et figure 4). La titration des échantillons d’intérêt avec diverses quantités de digitonine est essentielle afin d’identifier les conditions qui permettent une solubilisation optimale, tout en préservant l’activité enzymatique et les interactions physiologiques des protéines. Le titrage doit être effectué avec des ratios variant entre 2 et 8 g/g26. Les résultats optimaux pour le foie, le muscle squelettique et les mitochondries cardiaques sont respectivement obtenus avec 4, 5 et 6 g de digitonine/g de protéine. Il convient de noter que la digitonine peut être remplacée par le Triton X-100, qui, dans des conditions optimales, entraîne une migration et une composition de SC similaires à celles observées avec la digitonine2. Cependant, ce détergent doit être utilisé avec prudence, car une augmentation relativement faible du rapport détergent/protéine (par exemple, de 1 à 1,5 g/g) peut entraîner une dissociation complète des assemblages SCs2, ce qui peut entraîner des incohérences expérimentales. Après extraction, les échantillons sont traditionnellement complétés par du bleu de Coomassie pour donner aux protéines une charge lorsqu’il est appliqué sur le gel, sauf pour le CN traditionnel-page20,26. Afin de minimiser l’exposition des protéines au bleu de Coomassie et à la dissociation potentielle des protéines labiles, les échantillons ne sont pas complétés par le bleu de Coomassie dans ce protocole.

Électrophorèse

CN-PAGE et BN-PAGE ont été utilisés pour étudier les complexes OXPHOS mitochondriaux, chacun d’eux ayant des avantages et des limitations distincts. Les conditions plus douces utilisées sous CN-PAGE (principalement l’absence de CB, qui a un effet de détergent), permet une meilleure préservation de l’activité in-gel de l’ATP synthase, et limite la dissociation des protéines labiles dans les SCs de poids moléculaire élevé et l’ATP synthase les assemblages26. Cependant, l’absence du colorant anionique CB dans les tampons d’extrait de protéine et d’électrophorèse provoque la migration des protéines en fonction de leur charge intrinsèque et de leur point isoélectrique, ce qui réduit la mobilité électrophorétique des protéines dans le gel26. En outre, en l’absence de CB, les protéines avec une charge négative insuffisante tendent à s’agréger, réduisant ainsi la résolution des complexes protéiques dans le gel20,26. Pour contourner ces limitations, la soi-disant CN-PAGE à haute résolution a été développée par Wittig et Schragger20. Dans ce protocole, le désoxycholate de sodium (COD) et divers détergents non ioniques bénins (DDM, Triton x 100) sont ajoutés au tampon cathodique pour maintenir les protéines membranaires solubilisées et imposer un changement de charge négatif sur les protéines, ce qui se traduit par une amélioration considérable de la résolution20.

Une caractéristique distinctive du présent protocole hybride CN/BN est qu’une résolution comparable peut être atteinte sans ces détergents. L’addition momentanée de CB au tampon cathodique au début de l’électrophorèse est suffisante pour limiter l’agrégation des protéines et améliorer la mobilité dans le gel (figure 3 et figure 4). En conséquence, cette technique hybride permet une excellente résolution d’assemblages SC distincts et une exposition très faible ou nulle aux détergents. La présence de faibles quantités de CB permet également une meilleure préservation de l’activité CV, une meilleure préservation des assemblages de CV dimères et oligomériques (figure 3 et Wittig et schägger 200526), et une réduction du bruit de fond bleu qui peut d’entraver la quantification des activités de gel, en particulier pour les CII et CIV (figure 2). De plus, l’absence de CB dans l’extrait protéique limite la perturbation des interactions labiles protéiques au sein des SCs. Par exemple, l’Association physique de l’ATP synthase avec ANT pour former le synthasome 33 ou avec la cyclophiline-D pour réguler l’ouverture de PTP 34 sont mieux vus en l’absence de CB. L’exposition momentanée au CB pendant l’électrophorèse seulement peut donc être utile pour révéler de nouvelles interactions protéiques au sein de SCs. globalement, ce protocole hybride CN/BN-PAGE permet ainsi de combiner des mesures précises et rapides de l’activité de gel avec des techniques impliquant l’électrophorèse 2D, l’immuno-détection et/ou la protéomique pour l’analyse avancée des SCs. Il convient de noter qu’avec l’intérêt croissant pour les SCs, un nombre croissant d’études utilisent des petits gels de 10 x 10 cm pour la PAGE native. Bien que cette approche puisse suffire à identifier les changements bruts dans l’abondance des assemblages SC, la faible capacité de séparation des petits gels est probablement limitée pour résoudre des réarrangements subtils ou pour couper des bandes distinctes pour l’analyse protéomique. En outre, plusieurs études utilisant des gels plus petits ont rapporté que le respirasome migse à la même taille que le dimère de l’ATPsynthase, ce qui rend difficile de les dissocier22. Par conséquent, l’utilisation de grands gels devrait être favorisée.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs aimeraient remercier Jenna Rossi pour son assistance technique, ainsi que le Dr. Mireille khacho, le Dr David Patten et le Dr Ujval Anil Kumar pour une discussion utile tout en développant cette méthode. Ce travail a été financé par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et le Conseil national des sciences et du génie (CRSNG). AC est récipiendaire du prix du doctorat-Frederick Banting et Charles Best Canada bourses d’études supérieures (IRSC).

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate Sigma D5637
6-amino caproic acid sigma A2504
Acrylamide Sigma A3553
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate sigma A3377
Anti-ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker Abcam ab14730 Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438
Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] Abcam ab14715 Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433
Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] Abcam ab14745 Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide Biorad 1610201
Brilliant Blue G Sigma 27815
COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) Invitrogen 459600 Lot number TI2637158, RRID AB_2532240
Cytochrome c from equine heart sigma C7752
Digitonin Sigma D141
Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps Thermo Fisher 13-310-660
Imidazole Sigma I0250
Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate Biorad 1651823
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems Biorad 1654120
NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) Invitrogen 459100 Lot number TD2536591, RRID AB_2532223
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma N6639
Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate Biorad 1651824
Phenylmethanesulfonyl floride Sigma P7626
Powerpack 1000 Biorad Serial Number 286BR 07171
PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right Biorad 1651902
PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs Biorad 1651811
PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell Biorad 1651873
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards Biorad 1652025
PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell Biorad 1651849
SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 VWR 11215-388
Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette Biorad 1703956
Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper Biorad 1703939
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Cuillerier, A., Burelle, Y. Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes. J. Vis. Exp. (147), e59294, doi:10.3791/59294 (2019).
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