En Vivo Microscopía bicolor tridimensional para estudiar las respuestas vasculares realizadas por la eyección ATP local utilizando una micro-pipette de vidrio
Summary
Presentamos un procedimiento de eyección local optimizado utilizando una micropipeta de vidrio y un método rápido de imagen hiperpila de dos fotones, que permite la medición precisa de los cambios de diámetro capilar y la investigación de su regulación en tres dimensiones.
Abstract
El mantenimiento de la función cerebral normal requiere un suministro suficiente y eficiente de oxígeno y nutrición por una compleja red de vasos. Sin embargo, la regulación del flujo sanguíneo cerebral (CBF) se entiende incompletamente, especialmente a nivel capilar. La microscopía de dos fotones es una poderosa herramienta ampliamente utilizada para estudiar CBF y su regulación. Actualmente, este campo está limitado por la falta de estudios in vivo sin microscopía de dos fotones que examinen (1) las respuestas de la CBF en tres dimensiones, (2) las respuestas vasculares realizadas y (3) las intervenciones localizadas dentro de la red vascular. Aquí, describimos un método 3D in vivo usando microscopía de dos fotones para estudiar las respuestas vasculares realizadas provocadas por la eyección local de ATP con una micro-pipeta de vidrio. Nuestro método utiliza imágenes rápidas y repetitivas de dos fotones hiperpila que proporcionan mediciones precisas de diámetro mediante la proyección de intensidad máxima de las imágenes obtenidas. Además, demostramos que este método también se puede utilizar para estudiar las respuestas astrocíticas de calcio 3D. También discutimos las ventajas y limitaciones de la inserción de micropipetas de vidrio y la imagen de hiperpila de dos fotones.
Introduction
El cerebro tiene una alta tasa de consumo de energía. Alrededor del 20% del oxígeno y el 25% de la glucosa consumida por el cuerpo humano se dedican a la función cerebral, mientras que el cerebro sólo ocupa el 2% de la masa corporal total. El mantenimiento de la función cerebral normal requiere un suministro suficiente y eficiente de oxígeno y nutrición por flujo sanguíneo en una compleja red de vasos. La actividad cerebral local y el flujo sanguíneo cerebral (CBF) están estrechamente acoplados, dependiendo de las propiedades funcionales de las neuronas, astrocitos, pericitos, células musculares lisas (SCD) y células endoteliales (ECs)1. Recientemente, las primeras órdenes de ramificación capilar de arteriolas penetrantes han surgido como un ‘hotspot’2,mostrando una regulación activa del flujo sanguíneo capilar. Se descubrió una respuesta vascular de conducta lenta (CVR) en este “punto caliente” en la corteza somatosensorial del ratón durante la estimulación del bigote y la eyección local (puffing) de ATP con una micropipeta de vidrio3.
Aunque la microscopía fluorescente de escaneo láser in vivo por dos fotones ha sido ampliamente utilizada para estudiar las respuestas neurovasculares en la corteza cerebral, la mayoría de los estudios midieron los diámetros de los vasos sanguíneos e investigaron su regulación en un plano x-y bidimensional (2D). Los desafíos son: En primer lugar, los vasos sanguíneos cerebrales y sus astrocitos abrazados, pericitas y SCM construyen ramas en tres dimensiones (3D). Por lo tanto, es crucial estudiar sus interacciones en 3D. En segundo lugar, incluso una pequeña cantidad de deriva en el foco afectará la medición precisa de los diámetros de los vasos y las señales fluorescentes celulares. Por último, los CCV son rápidos y de gran alcance en tres dimensiones. El escaneo de volumen 3D es óptimo para detectar VOR y revelar sus mecanismos. Implementamos un objetivo motor piezoeléctrico en un microscopio de dos fotones para estudiar la corteza somatosensorial de ratón in vivo, permitiendo mediciones precisas de diámetro mediante proyecciones de intensidad máxima de las imágenes obtenidas.
Las micropipetas de vidrio se han utilizado con frecuencia para estudios cerebrales in vivo, por ejemplo, para dardos orgánicos de carga masiva4, registro de EEGs5 y para la sujeción de parches6. No obstante, persisten limitaciones. Comúnmente, la punta de la micro-pipeta de vidrio se coloca de forma imprecisa, o la micro-pipeta no se utiliza para las intervenciones locales. Aquí, hemos optimizado el procedimiento de inserción de micro-pipetas y eyección local.
Además, la combinación de microscopía 3D de dos fotones e indicadores fluorescentes codificados genéticamente ofrece una oportunidad sin precedentes para investigar el acoplamiento neurovascular en un ámbito 3D. En este estudio, aprovechamos esto e inyectamos vectores virales que llevaban indicadores específicos de calcio codificados genéticamente en la corteza somatosensorial del ratón. Los astrocitos, así como los diámetros de los recipientes, se crearon simultáneamente combinando diferentes marcadores fluorescentes.
En general, presentamos un método optimizado de eyección local (puffing) por micropipeta de vidrio e imagen rápida de hiperpila de dos fotones, que permite la medición precisa de los cambios de diámetro capilar. Además, nuestro método proporciona una herramienta novedosa para estudiar simultáneamente perfiles 3D de respuestas Ca2+ en astrocitos y respuestas de diámetro vascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un desafío para los estudios vasculares es la medición precisa de los diámetros de los vasos. El método que describimos aquí utilizó un objetivo piezoeléctrico motorizado para crear imágenes hiperapiladas rápidas y repetitivas mediante microscopía de dos fotones. En primer lugar, este método permite exámenes repetidos de la arteriola penetrante, 1o orden y 2o orden capilares sin pérdida de enfoque y condujo al descubrimiento de respuestas vasculares lentamente realizadas en capilares in vivo.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Lundbeck, la Fundación NOVO-Nordisk, el Consejo Danés para la Investigación Independiente Ciencias Médicas, y la Beca de la Fundación NORDEA al Centro para el Envejecimiento Saludable.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
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