In vivo tridimensional microscopia de dois fótons para estudo conduzido respostas vasculares por ejeção ATP local usando uma micro-pipeta de vidro
Summary
Nós apresentamos um procedimento local aperfeiçoado da ejeção usando uma micro-pipeta de vidro e um método rápido da imagem latente do hyperstack do dois-fotão, que permita a medida precisa de mudanças capilares do diâmetro e a investigação de sua regulação em três dimensões.
Abstract
A manutenção da função cerebral normal requer um suprimento suficiente e eficiente de oxigênio e nutrição por uma complexa rede de vasos. No entanto, a regulação do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) é incompletamente compreendida, especialmente no nível capilar. A microscopia do dois-fotão é uma ferramenta poderosa amplamente utilizada para estudar CBF e sua regulação. Atualmente, este campo é limitado pela falta de estudos in vivo de microscopia de dois fótons examinando (1) respostas de CBF em três dimensões, (2) realizaram respostas vasculares e (3) intervenções localizadas dentro da rede vascular. Aqui, nós descrevemos um método de in vivo 3D usando a microscopia do dois-fotão para estudar as respostas vasculares conduzidas eliciadas pela ejeção local do ATP com uma micro-pipeta de vidro. Nosso método usa a imagem latente rápida e repetitiva do dois-fotão do hyperstack que fornece medidas precisas do diâmetro pela projeção da intensidade máxima das imagens obtidas. Além disso, nós mostramos que este método pode igualmente ser usado para estudar respostas astrocytic do cálcio 3D. Nós igualmente discutimos as vantagens e as limitações da inserção de vidro da micro-pipeta e da imagem latente do hyperstack do dois-fóton.
Introduction
O cérebro tem uma alta taxa de consumo de energia. Cerca de 20% do oxigênio e 25% da glicose consumida pelo corpo humano são dedicados à função cerebral, enquanto o cérebro só ocupa 2% da massa corporal total. A manutenção da função cerebral normal requer um suprimento suficiente e eficiente de oxigênio e nutrição pelo fluxo sanguíneo em uma complexa rede de vasos. A atividade cerebral local e o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) são acoplados de forma robusta, dependendo das propriedades funcionais dos neurônios, astrócitos, pericytes, células musculares lisas (SMCs) e células endoteliais (ECs)1. Recentemente, as primeiras poucas ordens dos capilares que ramificaram-se das arteríolas penetrantes emergiram como um ‘ hotspot ‘2, mostrando a regulação ativa do fluxo sanguíneo capilar. Uma resposta vascular conduzida lenta (CVR) foi descoberta neste ‘ hotspot ‘ no córtice somatosensory do rato durante a estimulação do whisker e a ejeção local (sopro) do ATP com uma micro-pipeta de vidro3.
Embora a imagem latente in vivo pela microscopia fluorescente da exploração do laser do dois-fóton seja usada extensamente estudando respostas neurovascular no córtice cerebral, a maioria dos estudos mediram diâmetros do vaso sanguíneo e investigaram seu regulamento em um plano de x-y bidimensional (2D). Os desafios são: em primeiro lugar, os vasos sanguíneos cerebrais e seus astrócitos abraçando, pericitos e SMCs constroem ramos em três dimensões (3D). Portanto, é crucial estudar suas interações em 3D. Em segundo lugar, mesmo uma pequena quantidade de deriva em foco afetará a medição precisa de ambos os diâmetros dos vasos e sinais fluorescentes celulares. Finalmente, os CVRs são rápidos e de longo alcance em três dimensões. a digitalização em volume 3D é ideal para detectar CVRs e revelar seus mecanismos. Nós implementamos um objetivo motor piezo em um microscópio do dois-fóton para estudar o córtice somatosensory do rato in vivo, permitindo medidas precisas do diâmetro por projeções da intensidade máxima das imagens obtidas.
As micro-pipetas de vidro têm sido freqüentemente usadas para estudos cerebrais in vivo, por exemplo, para corantes orgânicos de carga a granel4, registro EEGs5 e para fixação de remendo6. No entanto, as limitações permanecem. Comumente, a ponta da micropipeta de vidro é colocada imprecisamente, ou a micropipeta não é usada para intervenções locais. Aqui, otimizamos o procedimento de inserção de micropipeta e ejeção local.
Além disso, a combinação da microscopia do dois-fotão 3D e de indicadores fluorescentes genetically-codificados oferece uma oportunidade sem precedentes de investigar o acoplamento neurovascular em um espaço 3D. Neste estudo, nós aproveitamos este e injetou vetores virais que carreg indicadores genetically-codificados específicos do cálcio do astrocyte no córtice somatosensory do rato. Os astrocytes assim como os diâmetros da embarcação foram imaged simultaneamente combinando marcadores fluorescentes diferentes.
No geral, apresentamos um método otimizado de ejeção local (soprando) por micropipeta de vidro e imagem de hiperpilha de dois fótons rápido, que permite a medição precisa das alterações do diâmetro capilar. Além disso, nosso método fornece uma nova ferramenta para estudar simultaneamente os perfis 3D de CA2 + respostas em astrócitos e respostas de diâmetro vascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um dos desafios para os estudos vasculares é a mensuração precisa dos diâmetros dos vasos. O método que nós descrevemos aqui usou um objetivo piezo motorizado para fazer a imagem latente rápida e repetitiva do hyperstack pela microscopia do dois-fotão. Firstly, este método permite examinações repetidas da arteriole penetrante, da ordem 1 doSt e dos capilares da ordem 2ND sem perda de foco e conduziu à descoberta de respostas vasculares lentamente conduzidas nos capilares in vivo. Em segu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação Lundbeck, a Fundação NOVO-Nordisk, o Conselho dinamarquês de pesquisa independente | Ciências médicas, e da Fundação NORDEA Grant para o centro de envelhecimento saudável.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
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