ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査
Summary
ガラスマイクロピペットと高速2光子ハイパースタックイメージング法を用いて最適化された局所突出手順を提示し、毛細血管の直径変化の精密な測定と3次元での調節の調査を可能にします。
Abstract
正常な脳機能の維持は、血管の複雑なネットワークによる酸素と栄養の十分かつ効率的な供給を必要とします。しかし、脳血流(CBF)の調節は、特に毛細血管レベルで、不完全に理解されていない。2光子顕微鏡は、CBFとその規制を研究するために広く使用される強力なツールです。現在、この分野は、(1)CBF応答を3次元で調べる生体内2光子顕微鏡検査の欠如、(2)血管応答の実施、および(3)血管ネットワーク内の局所的介入の欠如によって制限される。ここでは、2光子顕微鏡を用いて3Dインビボ法を用いて、ガラスマイクロピペットを用いてATPの局所的な駆出によって引き起こされた血管応答を調べた。我々の方法は、得られた画像の最大強度投影による正確な直径測定を提供する高速かつ反復的なハイパースタック2光子イメージングを使用しています。さらに、この方法は、3D星状カルシウム応答の研究にも用いることができることを示す。また、ガラスマイクロピペット挿入と2光子ハイパースタックイメージングの利点と限界についても説明します。
Introduction
脳はエネルギー消費率が高い。酸素の約20%と人体が消費するブドウ糖の25%は脳機能に専念し、脳は全体重の2%しか占めかねない。正常な脳機能の維持は、血管の複雑なネットワーク内の血流による酸素と栄養の十分かつ効率的な供給を必要とします。局所的な脳活動および脳血流(CBF)は、ニューロン、星状細胞、周辺細胞、平滑筋細胞(SMC)および内皮細胞(IC)1の機能特性に応じて、強く結合される。最近、動脈を貫通して分岐する毛細血管の最初のいくつかの注文は、毛細血管血流の活発な調節を示す「ホットスポット」2として出現している。遅い伝導血管応答(CVR)は、ガラスマイクロピペット3を用いてATPのウィスカー刺激と局所的な吐出(パフ)の両方の間にマウスの身体感覚皮質のこの「ホットスポット」で発見された。
2光子レーザー走査蛍光顕微鏡による生体内イメージングでは、大脳皮質における神経血管応答の研究に広く用いられてきたが、ほとんどの研究は血管の直径を測定し、2 次元 (2D) x-y 平面。課題は、まず、脳血管とその受け入れ星細胞、ペリサイト、SMCが3次元(3D)で枝を構築します。したがって、3Dで相互作用を研究することが重要です。第二に、焦点のドリフトの少量であっても、容器の直径と細胞蛍光信号の両方の正確な測定に影響を与えます。最後に、CCVは3次元で高速かつ広範囲に及びます。3D ボリューム スキャンは、CCV を検出し、そのメカニズムを発表するのに最適です。2光子顕微鏡でピエゾモーターの目的を実装し、マウスの体感覚皮質を生体内で研究し、得られた画像の最大強度投影による正確な直径測定を可能にした。
ガラスマイクロピペットは、例えば、有機染料4をバルクロードするために、例えば、GMG5を記録し、パッチクランプ6のために、生体内脳研究で頻繁に使用されている。それにもかかわらず、制限は残っています。一般に、ガラスマイクロピペットの先端が不正確に配置されるか、マイクロピペットが局所的介入に使用されない。ここでは、マイクロピペット挿入と局所的な排出の手順を最適化した。
さらに、3D 2光子顕微鏡と遺伝的にコード化された蛍光指標の組み合わせは、3Dスコープで神経血管結合を調べる前例のない機会を提供します。本研究では、これを利用して、アストロサイト特有の遺伝的にコードされたカルシウム指標をマウスの身体感覚皮質に注入した。アストロサイトと血管径は、異なる蛍光マーカーを組み合わせることにより同時に画像化した。
全体として、ガラスマイクロピペットによる局所的な排出(パフ)と高速2光子ハイパースタックイメージングにより、毛細血管径変化の正確な測定が可能な方法を提示します。さらに、我々の方法は、星状細胞および血管直径応答におけるCa2+応答の3Dプロファイルを同時に研究するための新しいツールを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
血管研究の1つの課題は、血管直径の正確な測定です。ここで説明する方法は、2光子顕微鏡による高速かつ反復的なハイパースタックイメージングを行うために、電動ピエゾの目的を使用した。第一に、この方法は、焦点を失うことなく、貫通動脈、第1次および第2次毛細血管の繰り返し検査を可能にし、生体内の毛細血管におけるゆっくりと行われた血管応答の発見につな?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ルンドベック財団、ノボノルディスク財団、デンマーク独立研究評議会によって支援されました |健康老化センターに対する医学とNORDEA財団補助金
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
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