בVivo תלת מימדי 2-פוטון מיקרוסקופית למחקר שנערכו תגובות כלי דם על ידי הוצאה ATP מקומי באמצעות זכוכית מיקרו פיפטה
Summary
אנו מציגים הליך הוצאה מקומית אופטימיזציה באמצעות זכוכית מיקרו-פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack שיטה הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויים בקוטר נימי וחקירה של התקנה שלה בשלושה ממדים.
Abstract
אחזקה של תפקוד המוח הרגיל דורש אספקה מספקת ויעילה של חמצן ותזונה על ידי רשת מורכבת של כלי קיבול. עם זאת, התקנה של זרימת דם מוחית (CBF) הוא מובן לחלוטין, במיוחד ברמת נימי. מיקרוסקופ שני פוטון הוא כלי רב עוצמה הנפוץ לחקר CBF והרגולציה שלה. כיום, שדה זה מוגבל על ידי העדר vivo שני פוטון במחקרים מיקרוסקופ בדיקה (1) התגובות CBF בשלושה מימדים, (2) ביצע תגובות כלי דם, ו (3) התערבויות מקומיות בתוך הרשת כלי הדם. כאן, אנו מתארים 3D בשיטה vivo באמצעות שני-פוטון מיקרוסקופ למחקר שנערכו תגובות כלי דם הרוויח על ידי הוצאה מקומית של ATP עם מיקרו פיפטה זכוכית. השיטה שלנו משתמשת hyperstack מהיר וחוזר הדמיה שני-פוטון מתן מדידות בקוטר מדויק על ידי הקרנת עוצמה מקסימלית של התמונות שהתקבלו. יתר על כן, אנו מראים כי שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור תגובות astrocytic סידן 3D. אנו דנים גם את היתרונות והמגבלות של החדרת מיקרו-פיפטה זכוכית, שני פוטון hyperstack הדמיה.
Introduction
למוח יש שיעור צריכת אנרגיה גבוהה. כ-20% מהחמצן ו -25% מהגלוקוז הנצרך על ידי גוף האדם מוקדשים לתפקוד מוחי, בעוד המוח תופס רק 2% ממסת הגוף הכוללת. אחזקה של תפקוד המוח הרגיל דורש אספקה מספקת ויעילה של חמצן ותזונה על ידי זרימת הדם ברשת מורכבת של כלי קיבול. פעילות מוחית מקומית וזרימת דם מוחית (cbf) הם מכבש בהתאם למאפיינים הפונקציונליים של נוירונים, אסטרוציטים, קרום הלב, תאים שריר חלק (smcs) ותאי האנדותל (ecs)1. לאחרונה, ההוראות הראשונות של נימים מסתעפת מפני חדירה בתוך העורקים הופיעו כ-“נקודה חמה”2, מראה התקנה פעילה של זרימת דם נימי. תגובה איטית של כלי הדם (CVR) התגלתה ב נקודה חמה זו בקליפת המגע של העכבר במהלך גירוי הויקר והפליטה המקומית (לעשן) של ATP עם מיקרו פיפטה מזכוכית3.
למרות בvivo הדמיה של שני פוטון לייזר סריקה מיקרוסקופ פלורסנט כבר בשימוש נרחב ללמוד תגובות נוירונימי בקליפת מוחין, רוב המחקרים שנמדדו בכלי הדם קטרים וחקר הרגולציה שלהם ב מישור x-y דו-ממדי (2D). האתגרים הם: ראשית, כלי דם מוחין והאסטרוציטים החובק שלהם, קרום הלב ו SMCs לבנות ענפים בשלושה ממדים (3D). לכן חשוב ללמוד את האינטראקציות שלהם ב-3D. שנית, אפילו כמות קטנה של סחיפה בפוקוס ישפיע על המדידה המדויקת של שני קטרים ואותות פלורסנט סלולריים. לבסוף, CVRs הם מהירים ומרחיקי לכת בשלושה מימדים. סריקת נפח תלת-ממד היא אופטימלית לזיהוי CVRs וחשיפת המנגנונים שלהם. אנו הטמיעה מטרה piezo מנוע במיקרוסקופ שני פוטון ללמוד קליפת המגע של העכבר בvivo, המאפשר מדידות קוטר מדויק על ידי התחזיות אינטנסיביות מקסימלית של התמונות שהתקבלו.
זכוכית מיקרו-פיפטות לעתים קרובות נעשה שימוש במחקרים במוח vivo, למשל, כדי לטעון בצובר צבעים אורגניים4, שיא eegs5 ועבור תיקון לסדר6. עם זאת, נותרו מגבלות. בדרך כלל, הקצה של מיקרו פיפטה זכוכית הוא imprecisely ממוקם, או מיקרו פיפטה לא משמש התערבויות מקומיות. כאן, יש לנו אופטימיזציה ההליך של החדרת מיקרו פיפטה והוצאה מקומית.
יתר על כן, השילוב של 3D two-פוטון מיקרוסקופ ו מקודד גנטית מחוונים פלורסנט מציע הזדמנות חסרת תקדים לחקור צימוד וסקולרית בטווח תלת-ממד. במחקר זה, ניצלנו את זה והזריקו וקטורים ויראליות נושאת מחווני סידן מהונדסים גנטית מסוימת לתוך קליפת המגע של העכבר. האסטרוציטים כמו גם קטרים של כלי היו התמונה בו על ידי שילוב סמנים פלורסנט שונים.
באופן כללי, אנו מציגים שיטה ממוטבת של הוצאה מקומית (לעשן) על ידי זכוכית מיקרו פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויי קוטר נימי. בנוסף, השיטה שלנו מספקת כלי הרומן ובמקביל לחקור פרופילי 3d של Ca2 + תגובות אסטרוציטים ו בקוטר כלי דם תגובות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אתגר אחד עבור לימודי כלי דם הוא המדידה המדויקת של קטרים הספינה. השיטה שאנו מתארים כאן השתמשו מטרה piezo ממונע להפוך מהיר וחוזר הדמיה היפרסטאק על ידי שני פוטון מיקרוסקופ. ראשית, שיטה זו מאפשרת בדיקות חוזרות של הarteriole חודר, 1 לסדר ו-2 נימים הזמנה ללא אובדן של מיקוד והובילו לגילוי של לאט ביצע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן לוננבק, קרן נובו-נורדיסק, המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הרפואה ומלגת קרן נורDEA למרכז להזדקנות בריאה.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
