In Vivo dreidimensionale zwei-photonische Mikroskopie zur Untersuchung von durchgeführten Gefäßreaktionen durch lokale ATP-Auswurf mit einer Glas-Mikropipette
Summary
Wir präsentieren ein optimiertes lokales Auswurfverfahren mit einer Glas-Mikropipette und einem schnellen Zwei-Photon-Hyperstack-Bildgebungsverfahren, das eine präzise Messung von Änderungen des Kapillardurchmessers und die Untersuchung seiner Regulierung in drei Dimensionen ermöglicht.
Abstract
Die Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion erfordert eine ausreichende und effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Ernährung durch ein komplexes Netzwerk von Gefäßen. Die Regulierung des zerebralen Blutflusses (CBF) ist jedoch unvollständig verstanden, insbesondere auf Kapillarebene. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig zur Untersuchung von CBF und seiner Regulierung eingesetzt wird. Derzeit ist dieses Feld durch den Mangel an in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie-Studien begrenzt, die (1) CBF-Antworten in drei Dimensionen untersuchen, (2) vaskuläre Reaktionen und (3) lokalisierte Interventionen innerhalb des Gefäßnetzwerks durchführen. Hier beschreiben wir eine 3D-in-vivo-Methode, die die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um durchgeführte Gefäßreaktionen zu untersuchen, die durch den lokalen Auswurf von ATP mit einer Glasmikropipette ausgelöst wurden. Unsere Methode verwendet schnelle und sich wiederholende Hyperstack-Zwei-Photon-Bildgebung, die präzise Durchmessermessungen durch maximale Intensitätsprojektion der erhaltenen Bilder ermöglicht. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Methode auch verwendet werden kann, um 3D-astrozytische Kalzium-Antworten zu untersuchen. Wir besprechen auch die Vorteile und Grenzen des Einsetzens von Mikropipetten aus Glas und der Zwei-Photonen-Hyperstack-Bildgebung.
Introduction
Das Gehirn hat eine hohe Energieverbrauchsrate. Etwa 20% des Sauerstoffs und 25% der Glukose, die vom menschlichen Körper verbraucht wird, sind der Gehirnfunktion gewidmet, während das Gehirn nur 2% der gesamten Körpermasse einnimmt. Die Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion erfordert eine ausreichende und effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Ernährung durch Dendurchfluss in einem komplexen Netzwerk von Gefäßen. Lokale Gehirnaktivität und zerebraler Blutfluss (CBF) sind robust gekoppelt, abhängig von den funktionellen Eigenschaften von Neuronen, Astrozyten, Pericyten, glatten Muskelzellen (SMCs) und Endothelzellen (ECs)1. Kürzlich haben sich die ersten Aufträge von Kapillaren, die von durchdringenden Arteriolen verzweigen, als “Hotspot” 2 herauskristallisiert,dereine aktive Regulierung des Kapillarblutflusses zeigt. An diesem “Hotspot” im somatosensorischen Kortex der Maus wurde sowohl bei der Whiskerstimulation als auch bei der lokalen Auswurfung (Puffing) von ATP mit einer Glasmikropipette3eine langsam durchgeführte Gefäßreaktion (CVR) entdeckt.
Obwohl die In-vivo-Bildgebung mittels zwei photonenlaserscanning-Fluoreszenzmikroskopie weit verbreitet ist, um neurovaskuläre Reaktionen in der Großhirnrinde zu untersuchen, wurden in den meisten Studien Blutgefäßdurchmesser gemessen und ihre zweidimensionale (2D) x-y-Ebene. Die Herausforderungen sind: Erstens bauen zerebrale Blutgefäße und ihre umarmenden Astrozyten, Pericyten und SMCs Zweige in drei Dimensionen (3D). Es ist daher wichtig, ihre Wechselwirkungen in 3D zu untersuchen. Zweitens wird schon eine geringe Menge an Drift im Fokus die genaue Messung sowohl der Gefäßdurchmesser als auch der zellulären Fluoreszenzsignale beeinflussen. Schließlich sind CVRs schnell und weitreichend in drei Dimensionen. Das 3D-Volumenscannen ist optimal für die Erkennung von CVRs und die Enthüllung ihrer Mechanismen. Wir implementierten ein Piezo-Motorobjektiv in einem Zwei-Photonen-Mikroskop, um den somatosensorischen Kortex der Maus in vivo zu untersuchen, wodurch präzise Durchmessermessungen durch maximale Intensitätsprojektionen der erhaltenen Bilder ermöglicht wurden.
Glas-Mikropipetten wurden häufig für in vivo Gehirnstudien verwendet, z.B. zum Massenladen organischer Farbstoffe4, Aufzeichnung EEGs5 und zum Patch-Spannen6. Dennoch bleiben Einschränkungen bestehen. Üblicherweise wird die Spitze der Glas-Mikropipette ungenau platziert, oder die Mikropipette wird nicht für lokale Eingriffe verwendet. Hier haben wir das Verfahren des Einsetzens von Mikropipetten und des lokalen Auswurfs optimiert.
Darüber hinaus bietet die Kombination aus 3D-Zweiphotonenmikroskopie und genetisch kodierten Fluoreszenzindikatoren eine beispiellose Möglichkeit, neurovaskuläre Kopplung in einem 3D-Bereich zu untersuchen. In dieser Studie nutzten wir dies und injizierten virale Vektoren, die astrozytenspezifische genetisch kodierte Kalziumindikatoren in den somatosensorischen Kortex der Maus trugen. Astrozyten sowie Gefäßdurchmesser wurden gleichzeitig durch die Kombination verschiedener fluoreszierender Marker abgebildet.
Insgesamt präsentieren wir eine optimierte Methode des lokalen Auswurfs (Puffens) durch Glas-Mikropipette und schnelle Zwei-Photonen-Hyperstack-Bildgebung, die eine präzise Messung von Kapillardurchmesseränderungen ermöglicht. Darüber hinaus bietet unsere Methode ein neuartiges Werkzeug, um gleichzeitig 3D-Profile von Ca 2+-Antworten in Astrozyten und Gefäßdurchmesserreaktionen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Herausforderung für Gefäßstudien ist die präzise Messung der Gefäßdurchmesser. Die Methode, die wir hier beschreiben, verwendete ein motorisiertes Piezoobjektiv, um eine schnelle und sich wiederholende Hyperstack-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie zu machen. Erstens ermöglicht diese Methode wiederholte Untersuchungen der durchdringenden Arteriole,1. Ordnung und 2. Ordnung Kapillaren ohne Fokusverlust und führte zur Entdeckung von langsam durchgeführten Gefäßreaktionen in Kapillaren in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Lundbeck-Stiftung, der NOVO-Nordisk Foundation, dem Dänischen Rat für unabhängige Forschung | Medical Sciences und die NORDEA Foundation Grant an das Center for Healthy Aging.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
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