في فيفو ثلاثي الأبعاد اثنين فوتون المجهري لدراسة الاستجابات الوعائية التي أجريت من قبل طرد ATP المحلية باستخدام الزجاج الماصة الصغيرة
Summary
نقدم إجراء طرد محلي محسّن باستخدام ماصة زجاجية صغيرة وطريقة تصوير سريعة من اثنين من الفوتونات، والتي تسمح بقياس دقيق للتغيرات في القطر الشعري والتحقيق في تنظيمه في ثلاثة أبعاد.
Abstract
الحفاظ على وظيفة الدماغ العادية يتطلب إمدادات كافية وفعالة من الأكسجين والتغذية من قبل شبكة معقدة من السفن. ومع ذلك، فإن تنظيم تدفق الدم الدماغي (CBF) غير مفهوم بشكل كامل، وخاصة على المستوى الشعري. اثنين من الفوتون المجهري هو أداة قوية تستخدم على نطاق واسع لدراسة CBF وتنظيمها. حاليا، هذا المجال محدود بسبب عدم وجود دراسات في الجسم الحي باثنين من الفوتون المجهري دراسة (1) استجابات CBF في ثلاثة أبعاد، (2) الاستجابات الوعائية، (3) التدخلات المحلية داخل شبكة الأوعية الدموية. هنا، ونحن نصف 3D في طريقة الجسم الحي باستخدام مجهرية اثنين فوتون لدراسة الاستجابات الوعائية التي أجريت الناجمة عن طرد المحلية من ATP مع الزجاج الماصة الدقيقة. تستخدم طريقتنا التصوير السريع والمتكرر باثنين من الفوتونات لتوفير قياسات دقيقة للقطر من خلال الإسقاط الكثافة القصوى للصور التي تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، فإننا نظهر أن هذه الطريقة يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة استجابات الكالسيوم الفلكية 3D. كما نناقش مزايا وقيود إدراج الماصة الصغيرة الزجاجية والتصوير باثنين من الفوتونات هايبرستاك.
Introduction
الدماغ لديه معدل استهلاك الطاقة عالية. حوالي 20٪ من الأكسجين و 25٪ من الجلوكوز المستهلكة من قبل جسم الإنسان مكرسة لوظيفة الدماغ، في حين أن الدماغ لا يحتل سوى 2٪ من كتلة الجسم الإجمالية. الحفاظ على وظيفة الدماغ الطبيعية يتطلب إمدادات كافية وفعالة من الأكسجين والتغذية عن طريق تدفق الدم في شبكة معقدة من الأوعية. يتم الجمع بين نشاط الدماغ المحلي وتدفق الدم الدماغي (CBF) بقوة، اعتمادا على الخصائص الوظيفية للخلايا العصبية، الخلايا النجمية، pericytes، خلايا العضلات الملساء (SMCs) والخلايا البطانية (ECs)1. في الآونة الأخيرة، ظهرت أول عدد قليل من أوامر الشعيراتالدموية المتفرعة من الأرتيريولس اختراق ك ‘نقطة ساخنة’ 2، مما يدل على تنظيم نشط لتدفق الدم الشعرية. تم اكتشاف استجابة الأوعية الدموية بطيئة أجريت (CVR) في هذه ‘نقطة ساخنة’ في القشرة الحسية الجسدية الماوس خلال كل من تحفيز شعيرات وطرد المحلية (النفخ) من ATP مع الزجاج الماصة الدقيقة3.
على الرغم من أن التصوير في الجسم الحي بواسطة اثنين من الفوتون اتّشِر المجهري الفلورسنت على نطاق واسع لدراسة استجابات الأوعية الدموية العصبية في القشرة الدماغية، فإن معظم الدراسات قامت بقياس أقطار الأوعية الدموية وبحثت في تنظيمها في ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) × y مستوى. التحديات هي: أولا، والأوعية الدموية الدماغية واحتضانها الخلايا النجمية، pericytes والشركات الصغيرة والمتوسطة بناء فروع في ثلاثة أبعاد (3D). ولذلك فمن الأهمية بمكان دراسة تفاعلاتها في 3D. ثانيا، حتى كمية صغيرة من الانجراف في التركيز سوف تؤثر على القياس الدقيق لكل من أقطار السفن وإشارات الفلورسنت الخلوية. وأخيراً، فإن تقارير السير الذاتية سريعة وبعيدة المدى في ثلاثة أبعاد. المسح الضوئي للحجم ثلاثي الأبعاد هو الأمثل للكشف عن CVRs والكشف عن آلياتها. نفذنا هدف محرك بيزو في المجهر اثنين من الفوتون لدراسة الماوس القشرة الحسية الجسدية في الجسم الحي، مما يسمح قياسات قطر دقيق من قبل التوقعات كثافة قصوى من الصور التي تم الحصول عليها.
وقد استخدمت في كثير من الأحيان الزجاج الماصات الصغيرة لفي دراسات الدماغ فيالجسم الحي، على سبيل المثال، لتحميل الجزء الأكبر الأصباغ العضوية 4، سجل EEGs5 والتصحيح لقط6. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود. عادة، يتم وضع طرف الماصة الصغيرة الزجاج بشكل غير دقيق، أو لا يتم استخدام الماصة الصغيرة للتدخلات المحلية. هنا، قمنا بتحسين إجراء الإدراج الماصة الدقيقة والإخراج المحلي.
وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين الفحص المجهري ثلاثي الدناضوئي والمؤشرات الفلورية المشفرة وراثياً يوفر فرصة غير مسبوقة للتحقيق في اقتران الأوعية الدموية العصبية في نطاق ثلاثي الدمركبة. في هذه الدراسة، استفدنا من هذا وحقن ناقلات الفيروسية تحمل مؤشرات الكالسيوم محددة وراثيا ترميز وراثيا في القشرة الحسية الماوس. تم تصوير الخلايا النجمية وكذلك أقطار الأوعية في وقت واحد من خلال الجمع بين علامات الفلورسنت المختلفة.
بشكل عام، نقدم طريقة محسنة للطرد المحلي (النفخ) بواسطة الماصة الزجاجية الدقيقة والتصوير السريع ثنائي الفوتون hyperstack، والذي يسمح بقياس دقيق للتغيرات في القطر الشعري. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا طريقة توفر أداة جديدة لدراسة في وقت واحد ملامح 3D من الاستجابات Ca2 + في الخلايا النجمية والاستجابات قطر الأوعية الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أحد التحديات التي يواجهها دراسات الأوعية الدموية هو القياس الدقيق لأقطار الأوعية الدموية. الطريقة التي نصفها هنا تستخدم هدف بيزو الآلية لجعل التصوير hyperstack سريعة ومتكررة عن طريق التصوير المجهري اثنين فوتون. أولا، يسمح هذا الأسلوب الفحوصات المتكررة للأرتيريول اختراق، 1st النظام و2 ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم مؤسسة لوندبيك، ومؤسسة نوفو نورديسك، والمجلس الدانمركي للبحوث المستقلة | العلوم الطبية، ومنحة مؤسسة NORDEA لمركز الشيخوخة الصحية.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
