侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

すべての実験は、オランダ王立芸術科学アカデミー動物福祉委員会のガイドラインに従って行われました。この原稿で使用される実験プロトコルは、中央コミュニシー・ディアプロヴェン(CCD)とインスタント・ヴォール・ディエレンヴェルツィン(IvD)によって承認されました。 1. 腫瘍細胞移植と頭蓋イメージングウィンドウ製剤 外科的準備 任意の株や性別の成体マウス(>6週齢)を使用してください。(フルアニゾン[神経レプチック]+フェンタニル[オピオイド])(0.4 mL/kg)+ベンゾジアゼピン鎮静剤(2mg/kg)を無菌水中で1:1:2の用量で注射してマウスを鎮静する。つま先のピンチによって動物の座り込み状態を評価します。注:このプロトコルでは、これらの実験で使用される腫瘍細胞株の同じ遺伝的背景(GL261)のために、女性および雄のC57BL/6マウスの両方が使用された。マウスは1.5時間完全に鎮静されたままになります, 代わりに, イソファランなどの吸入麻酔を使用します (1.5%- 2% イソファラン/O2混合物). マウスを立体フレームに取り付け、鼻クランプと2本のイヤーバーを使用してヘッドを固定します。 体温を保つために暖房ランプを使用してください。暖房ランプは注意して使用する必要があります、代わりに水再循環加熱パッドを使用することができます。 マウスの角膜を乾燥から保護するために目の中に目のミントを適用します。 鋭いはさみを使って頭蓋骨の毛皮を剃り(マウスの目から頭蓋骨の基部まで背面領域)、露出した皮膚を70%のエタノールで消毒する。 鋭いはさみで皮膚を円形に切り、綿棒で下の骨膜をこすり落とします。リドカイン1%+エピネフリン1:100,000を5分間塗布し、綿棒で過剰を除去する。 皮膚の縁をシアノクリレート接着剤で頭蓋骨に接着します。 4倍の倍率で解剖ステレオ顕微鏡の下に立体フレームを配置します。 解剖顕微鏡を通して頭蓋骨を視覚化し、右頭頂部骨の上に直径5mmの円形溝をドリルします。頭蓋骨への圧力を避け、表面的にのみこのステップを慎重に実行します。 皮質バッファー(125 mM NaCl、5 mM KCl、10 mMグルコース、10 mM HEPESバッファー、2mM MgSO 4、および2 mM CaCl2 [pH 7.4])のドロップを適用し、薄い鉗子を使用して骨フラップを持ち上げます。 次の手順については、特に指定がない限り、脳表面を皮質バッファーで覆った状態に保ちます。 解剖顕微鏡の下で、脳表面を視覚化し、湾曲した、テーパー、非常に細かい点ピンセットを使用してデュラ母体を除去する。この段階で出血が発生した場合は、吸収性ゼラチンスポンジを使用して停止します。 腫瘍細胞注射 PBSの〜3 μLで所望の量の蛍光腫瘍細胞を再中断する(例えば、このプロトコルに示す実験のために、1 x 105 GL261細胞を注入した)。注:任意の蛍光マーカーを使用することができますが、核マーカーは、分析中に個々の腫瘍細胞を追跡することを強くお勧めします。さらに、H2Bなどのヒストン結合蛍光マーカーを用いて染色体凝縮を可視化し、細胞分裂を監視することができます。Dendra2のような写真切り替え可能なマーカーを使用すると、数日間にわたって腫瘍細胞の写真マーキングと追跡が可能になります4,13. 10 μLのガスタイトシリンジに10μLのガスタイトシリンジにポイントスタイル2針を入れ、立体マニピュレータアームに固定します。 皮質バッファーを取り外します。注射器の先端を頭蓋の真ん中に置き、頭蓋骨の表面から0.5mmの深さで挿入します。必要に応じて、腫瘍細胞懸濁液を収容するために脳内に小さなスペースを作成します。このために、注射器を深さ1mmまで挿入し、注射前に最大0.5mmまで取り出します。 皮質バッファーのドロップを適用します。 マイクロシリンジポンプインジェクター(250~400 nL/min)を使用してセル懸濁液をゆっくりと注入します。注射器を取り外し、必要に応じて出血を止めるために吸収性ゼラチンスポンジを使用してください。 頭蓋イメージングウィンドウの準備 皮質バッファーを取り外し、窓の下の気泡を避けるために、開頭術部位にシリコーンオイルの滴を置きます。 露出した脳を6mmのカバースリップで密封します。カバースリップと頭蓋骨の間にシアノクリレート接着剤を適用します。細かいピンセットの助けを借りて、頭蓋骨に対するカバースリップを静かに押して、脳とカバースリップの間の距離を最小限に抑えます。 カバースリップの端を覆う、頭蓋骨の表面に歯科用アクリルセメントを適用します。頭蓋の周りに薄いステンレスリング(外径1.5mm、内径1mm)を置き、歯科用セメントを乾燥させます。必要に応じて、頭の上にリングを固定するために、境界線にいくつかの接着剤を追加します。注:この頭部固定システムは反転した顕微鏡のイメージ投射のために最適である:イメージ投射箱に埋め込まれた小さい磁石は頭蓋イメージ投射窓(CIW)の固定を促進する。このプロトコルに示す実験では、反転顕微鏡を用いた。直立した顕微鏡のために、固定はねじまたはリングに合う版の助けを借りて顕微鏡に付けることができる溝が付いている棒かリングによって達成することができる。 疼痛管理のために、100 μg/kgのブプレノルフィンを皮下に注入し、動物が加熱パッドで回復できるようにします。 濃縮のために細断された紙で個々のケージにマウスを置きます。マウスを毎日毎日注意深く監視し、その後、通常の動作、反応性、および外観を、その後、週に2回監視します。 2. イントラバイタルイメージング 注:腫瘍細胞注射と第1のインビタルイメージングセッションとの間の時間間隔は、使用される腫瘍細胞株のタイプに依存する。このプロトコルに示す実験では、1x 105 GL261細胞を注入し、10日後に画像化した。 イメージング調製 イソファラン吸入麻酔をフェイスマスク(1.5%~2%イソファルラン/O2混合物)を用いてマウスを鎮静する。 脱水を防ぐために、100 μLの生理生理生理生理物バッファーでマウスを皮下に注入します。注:長期イメージングのために、マウスは皮下注入ポンプを通して水和することができる。 マウスを上向きにイメージボックスに配置します。直径1mmの穴と開口部の周りに埋め込まれた小さな磁石を備えた金属板を使用して、CIWをイメージングボックスに固定します。フェイスマスクを通してイソルランを導入し、ボックスの反対側の出口(0.8%~1.5%イソルラン/O2混合物)で換気します。必要に応じて、テープを使用してマウス本体を固定します。注:血管可視化または他の染料のために蛍光標識されたデキストランは、この時点で静脈内に注入されてもよい。 必要に応じて、パルスオキシメータと加熱プローブを使用して、マウスのバイタルを監視します。注:この実験では、マウスがイメージング期間(2~3時間)を通じて安定していたため、パルスオキシメータと加熱プローブを使用する必要はなかった。ただし、イメージング時間を長くするためには、より徹底的な監視が必要になる場合があります。 25x(例えば、HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm)の水の目的を最も低いz位置に設定し、大きな水滴を加えます。注:水浸漬マイクロディスペンサーの使用は、科学者が実験中に水を追加することを可能にするので、長期実験のために強くお勧めします。あるいは、乾燥した目的を使用することができる。 37 °Cに保たれた暗い気候室を備えた顕微鏡にイメージ投射箱を移す。水滴が触れるまで、CIWカバースリップに目的を持って来ます。 エピ蛍光モードを使用して、眼球を通して腫瘍を観察し、細胞に焦点を合わせます。 タイムラプス画像取得 画像に関心のあるいくつかの位置を選択し、ソフトウェアに座標を記録します。選択した位置が腫瘍の異なる部位からの代表的な位置であることを確認します(各腫瘍は異なる場合がありますが、一貫性を確保するために、腫瘍コアとすべてのマウスのエッジに対して同じ量の位置を選択します)。注:腫瘍の一部または目に見える腫瘍全体のタイルスキャンを実行することができます。しかし、腫瘍が大きい場合、この方法は画像間の時間経過を増加させる。さらに、腫瘍細胞が速く移動する場合、時間の経過とともに同じ細胞を追跡することは困難な場合があります。 マルチフォトンモードに切り替え、レーザーを正しい波長に合わせて調整します。なお、光による損傷を避けるため、より高い波長が望まれる。注:Dendra2イメージングでは、960 nmの波長が使用されました。これらの実験で使用される目的では、1.3のズームは腫瘍核の良好な解像度を得て、腫瘍の代表的な領域をスキャンするのに十分であった。 ライブモードに移動し、腫瘍細胞の分解能を損なうことなく腫瘍細胞の最大体積を獲得するために、各位置のz -stackを定義します。画像間のステップ サイズを 3 μm として定義します。 双方向モードを使用して、スキャン速度を上げます。画像の解像度は、512 x 512 ピクセルを少なくとも使用する必要があります。 2時間毎に20分ごとに異なる位置で腫瘍体積の画像を取得し、各画像取得の前に目的に水を追加します。注:タイムラプス画像は、ソフトウェアで適切なタイムラプスを設定することで自動的に取得できます。ただし、マウスは移動でき、位置またはzスタックは時間の経過と同時にシフトし、データ損失を引き起こす可能性があります。したがって、時間経過を手動で実行し、取得間のxyzシフトをチェックして調整することをお勧めします。 このステップでは、必要に応じて、Dendra2蛍光マーカーをフォトスイッチする。注:タイムラプスイメージングとは対照的に(個々の腫瘍細胞の特性とそれらが時間の経過とともにどのように変化するかを研究することができます)、これは数日間にわたって脳内の腫瘍細胞浸潤の領域を研究することができます4。このステップの詳細な説明は、グリゴリエビッチら13によって説明されています. 最後の画像を取得した後、ステージからマウスを削除し、加熱パッド上で回復できるようにします。脱水を防ぐために、100 μLの生理生理生理を皮下に与えることができる。生検のような傷害が行われるまで、マウスをケージに入れる。 3. 生検様損傷およびCIW置換 最初のイメージングセッションの1日後に腫瘍部位で生検様損傷を作成する。注:あるいは、部分的な腫瘍除去のような別の手順を行うことができる。 ステップ2.1.1で前述したように、イソファラン吸入麻酔を使用してマウスを鎮静する。注:注射麻酔を使用することができますが、この手順はCIW移植よりも短く、吸入麻酔はマウスが鎮静されたままの時間を正確に制御し、短縮することを可能にします。 マウスをステレオタックスフレームに置き、2本のイヤーバーとノーズクランプで頭を固定します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認してください。立体手術には麻酔マスクを使用して、手術中にマウスを鎮静させます。 綿棒をアセトンに浸し、カバースリップの端に広げて、カバースリップを脳に対する接着剤を柔らかくします。 カバースリップの下に薄い点の鉗子をスライドさせて持ち上げます。この時点でカバースリップが壊れた場合は、鉗子を使用してガラスの破片を取り除きます。 脳を湿らせるように皮質バッファーを適用します。 腫瘍に25Gの針を1mmの深さに浸し、必要に応じてゼラチン滅菌スポンジを塗布して出血を止める。注:このステップは、より正確に腫瘍領域を識別するために蛍光立体顕微鏡下で行うことができます(腫瘍が小さすぎる場合)。さらに、蛍光ポリスチレン1μmビーズの1 μL溶液を穿刺中に注入し、生検領域を同定することができる。 脳表面をシリコーンオイルで密封し、上部に6mmのカバースリップを接着します。 4. 繰り返しイメージング 生検様損傷を与えた1日後(および必要に応じて連続した日に)、上記のステップ2で説明したように、腫瘍細胞の挙動が時間の経過とともにどのように変化するかを評価するために、インビタルイメージングを繰り返します。腫瘍領域全体を代表する腫瘍のいくつかの位置を選択します。注:蛍光ビーズを使用して生検領域を同定した場合、非生検領域と比較して生検領域における腫瘍細胞の挙動を画像化するためにそれらを局所化する。 5. 画像解析 タイムラプスイメージが手動で取得された場合は、それらを 1 つのフォルダに結合します。 顕微鏡に関連する商用ソフトウェア(LasXまたはLAS AFなど)でタイムラプスLIFファイルを開きます。[プロセスプロセス>プロセス ツール>マージ]タブを選択します。時間シーケンスの最初の画像を選択し、[最初]をクリックします。時間シーケンスの 2 番目のイメージを選択し、[秒]をクリックします。[寸法の差し込み]で、時間のtを選択します。[適用]をクリックします。2 つのタイムポイントを持つ新しいファイルが生成されます。シーケンスの最初のイメージとして新しく生成されたファイルを使用して、すべてのタイムポイントに対してこのプロセスを繰り返します。 xyzシフトの取得済みzスタックを修正します。注: このプロトコルで説明されている実験では、カスタム設計の Visual Basic ソフトウェア プログラムが修正に使用されました。また、ImageJ や Imaris などの他の利用可能なソフトウェアを使用することもできます。 マージされたタイムラプス ファイルを右クリックして、ソフトウェアから TIFF ファイルをエクスポートします。[RAWデータを保存]を選択します。エクスポートされたファイルは、チャネル、時刻、および z位置に従って名前が付けられた 1 つのフォルダにエクスポートされます。 カスタム設計の Visual Basic ソフトウェア プログラムで TIFF ファイルを開きます。 タイムポイント、z スタック、およびチャネルの数を定義します。 外観の順序で各チャンネルに色を割り当てます。 [フォーム表示]パネルで、各タイムポイントで、上 (U) または下 (D) ボタンをクリックしてzのシフトを修正します。 イントラバイタル イメージビルディングパネルで、xy シフトの修正に使用するチャネルを選択します。腫瘍細胞からのシグナルに基づいて、修正する緑色のチャネルを選択します。[自動] をクリックしてxy補正を行います。 修正された画像を、3 つの連続したz-stack の最大投影として書き出します。パネル選択で、エクスポートする最初の (開始)と最後の (End) z-スライスの番号を紹介します。[最大]を選択します。Z のフォルダを個別に選択します。[Do] をクリックします。 それらのそれぞれについて、3つのz-stack、タイムラプス画像は別のフォルダにエクスポートされます。 必要に応じて、組織弾性変形に対して補正する。注:組織弾性変形実験では、剛性および弾性組織変形14を補正するためにマッチモーション補正ソフトウェアプログラムが使用された。 タイムラプスムービー内の完全なz-stack 内の単一のセルを追跡します。注:腫瘍細胞は、例えば、ImageJプラグイン(MTrackJ)を使用して手動で追跡することができます。正確ですが、これはxy平面に限定され、非常に時間がかかります。あるいは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞セグメンテーション(例えば、イマリスソフトウェア)を使用して、全z-体積全体を通して自動的に追跡することができる。 しかし、高密度の腫瘍では、自動トラッキングの精度が低く、より多くのトラッキングエラーが発生する可能性があります。 各タイムラプスシリーズ(3つの連続したz -stacksの場合)を個別に開いて追跡します。タイムラプスイメージを含むフォルダを ImageJ にドラッグします。 タブプラグイン>トラッキング> MtrackJを選択します。各タイムポイントで[追加]を選択し、各セルをクリックして、個々のセルを追跡します。 [測定]をクリックしてファイルを保存して、トラックのメジャーを抽出します。